[發(fā)明專利]木槿屬植物全基因組DNA的提取方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310586697.0
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103555713A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 於朝廣;殷云龍;蘆治國;徐建華
• 申請（專利權）人: 江蘇省中國科學院植物研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發(fā)明屬于一種DNA的提取方法領域，具體涉及木槿屬植物全基因組DNA的提取方法。

背景技術

木槿屬(Hibiscus?Linn)植物大部分種類花色艷麗，大多于夏、秋開花，花朵繁茂且色彩豐富，花期較長，觀賞價值極高，是世界上重要的觀賞花卉之一。木槿屬植物約200余種，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。我國有24種和16變種或變型，產于全國各地。在我國，木槿屬植物在園林應用上較多，主要是因為夏、秋季開花的植物較少，而木槿屬植物能從6月初開花，可持續(xù)到9月末，且花色艷麗。目前，木槿屬植物在園林綠化上仍是采用一些傳統(tǒng)品種，在新品種選育方面仍處于初級階段，而通過充分利用木槿屬植物種質資源，培育木槿屬植物新品種，特別是挖掘木槿屬植物觀賞價值高的耐鹽堿新品種，這對我國沿海的公路、城市和庭園綠化具有重要的意義。申請人于2003年起開始進行木槿屬植物的雜交育種工作，獲得了雜交新品種，其雜交育種方法于2011年獲得授權發(fā)明專利(ZL200710190933.1)。隨著雜交工作的持續(xù)進行，為了減少對雜交后代培育和管理的工作量，節(jié)約相關的物力和財力，對雜交后代進行早期雜種鑒定工作顯得越來越重要。過去，木槿屬植物的雜種鑒定通常是通過形態(tài)變異來進行判斷，特別是通過植株開花時的花色和花朵的大小以及其它外部形態(tài)特征來進行雜種鑒定，這通常需要種植2-3年才能完成雜種鑒定。而現在隨著分子生物學的深入研究，雜交種子播種當年即可應用分子標記方法來進行雜交鑒定，判定其是否為真雜交，去除假雜種，保留真雜種，這種應用分子標記方法進行雜交后代的早期鑒定，可節(jié)省大量的人力、物力和財力。同時在木槿屬植物新品種保護方面，分子標記技術可在木槿新品種實質審查和品種權糾紛司法鑒定中廣泛應用。

我們在提取木槿屬植物DNA進行分子鑒定研究時發(fā)現，木槿屬植物葉片糖、酚含量特別高，應用傳統(tǒng)的CTAB法進行提取，當用酒精沉淀時，DNA與糖等裹在一起，很難將其分開，挑取出也無法溶解。而當單純用DNA提取試劑盒進行DNA提取時，發(fā)現結果也不理想，雖然吸附柱將糖類等物質過濾，但提取的DNA濃度極低，幾乎檢測不到。但到目前為止，還沒有關于木槿屬植物全基因組DNA提取方法的文獻報道，要提取到高質量、高濃度的木槿屬植物DNA必須研究一種新的提取方法。

發(fā)明內容

本發(fā)明是針對上述情況，提供一種木槿屬植物全基因組DNA的提取方法，為通過分子標記等技術對木槿屬植物基因組學的研究奠定基礎。

本發(fā)明充分利用CTAB法對木槿屬植物全基因組DNA有效的抽提效果和DNA提取試劑盒的吸附柱將多糖、酚類物質等充分過濾的效果，將2種方法配合使用，對木槿屬植物的DNA進行提取，提取過程如下：

(1)取2g左右木槿屬植物幼葉，用液氮研磨成粉狀，轉入1.5mL的離心管中(以1／2管為宜)，加入2％的CTAB裂解液500uL(1升2％的CTAB?DNA提取裂解液包含：CTAB20g、NaCl81.816g、PVP20g、1M?Tris-HCl(PH8.0)100mL、0.5MEDTA-Na₂(PH=8.0)40mL、ddH₂O800mL，最后定溶到1L)和4uL?RNAase(10mg／mL)，攪勻后，65℃水浴1hr，每20min搖勻一次。

(2)水浴結束后將樣品從水浴鍋取出冷卻，冷卻至室溫后加入等體積的氯仿／異戊醇(24：1)，混勻后在搖床上搖動1hr。

(3)將(2)中搖勻的樣品在冷凍離心機12000rpm離心10min，小心吸取上清液到一個新的1.5mL離心管。

(4)加入130uL?DNA提取試劑盒緩沖液AP2，充分混勻，冰箱放置5min，14000rpm離心10min，吸取上清到1個新的1.5mL離心管。

(5)計算上清量，加入1.5倍體積的DNA提取試劑盒AP3／E溶液，吹打混勻。

(6)將(5)中所得混合物加入一個吸附柱AC中(DNA提取試劑盒配制)，13000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，再加入剩余的溶液，再次離心。

(7)加入700uL漂洗液WB(DNA提取試劑盒配制)，12000rpm離心1min，棄掉廢液。

(8)加入500uL漂洗液WB(DNA提取試劑盒配制)，12000rpm離心1min，棄掉廢液。

(9)將吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm離心2min，盡量除去漂洗液。