[發明專利]假諾卡氏菌及其發酵生產骨化二醇的方法

有效

• 申請號: 201310586259.4
• 申請日: 2013-11-21
• 公開（公告）號: CN103898004A
• 公開（公告）日: 2014-07-02
• 發明（設計）人: 曾志剛;梁彥明;翟龍飛;徐欣;許之暉
• 申請（專利權）人: 中國醫藥集團總公司四川抗菌素工業研究所;太原市威爾潞威動物保健品有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/02;C12R1/01
• 代理公司: 成都立信專利事務所有限公司 51100
• 代理人: 馮忠亮

技術領域：

????本發明涉及一種用于發酵生產骨化二醇的假諾卡氏菌，以及利用該假諾卡氏菌發酵生產骨化二醇的方法。

背景技術：

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）日益成為嚴重威脅老年人的健康的一種慢性疾病；維生素D類藥物中的骨化二醇（25—羥基維生素D₃）是自然存在人體內的維生素D₃的活性代謝產物；多年來，骨化二醇主要用于治療老年人骨質疏松癥等各種慢性骨紊亂，以及與慢性腎衰竭有關的代謝性骨疾病，低鈣血病。另外，骨化二醇近年也作為飼料添加劑用于飼料行業。

骨化二醇的制備有化學合成和生物發酵兩種方法；化學合成反應步驟繁多、需要昂貴試劑、反應過程中會產生外消旋體，需要進行復雜的拆分過程，不僅大大影響收率，而且難以拆分完全，而且化學合成生產骨化二醇會對環境產生較大的污染。而微生物發酵的方式能夠利用微生物細胞內的酶特異性的解決骨化二醇的手性結構問題，其生產條件溫和，收率高，成本低廉，環境友好，成為一種有效替代化學合成的方法。但是現有方法中添加的維生素D₃的濃度低，專利USP5474923添加維生素D₃的最大濃度僅為1000ug/ml，這不利于通過增加維生素D₃的投料量來提高骨化二醇的產量；而且目前用微生物發酵方式制備骨化二醇的相關研究僅限于實驗室水平，沒有工業規模深層發酵生產骨化二醇的技術方案。?

發明內容：

本發明的目的是提供一種維生素D₃的投料量高，產品收率高，質量好，可工業規模發酵生產骨化二醇的假諾卡氏菌株及其發酵生產骨化二醇的方法。

本發明是這樣實現的：?

假諾卡氏菌，其特征在于其自編號為SIIA2243,其拉丁文名Pseudonocardia?autotrophica，保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期∶2013年07月17日，保藏編號CGMCCNo.7935。

假諾卡氏菌發酵生產骨化二醇的方法，生產過程包括：?

（1）菌株SIIA2243依次經過三角燒瓶，種子罐，發酵罐進行深層培養發酵，

（2）向菌株SIIA2243的發酵液中補入一種或者多種環糊精化合物的溶液和維生素D3，繼續發酵得發酵液，

（3）將步驟(2)的發酵液，用有機溶劑進行萃取，濃縮，柱層析及結晶后得到骨化二醇成品。

步驟(1)中菌株SIIA2243的種子及發酵罐培養基含有蛋白胨、玉米漿、葡萄糖、黃豆粉、氯化鈉、磷酸二氫鉀。?

步驟(2)中菌株SIIA2243的發酵液在補入一種或者多種環糊精化合物的溶液和維生素D₃后，繼續發酵的時間為1～4天。?

步驟(2)中菌株SIIA2243的發酵液在補入一種或者多種環糊精化合物的溶液和維生素D₃后的24hr內，通過增加攪拌軸轉速或者增加空氣流量來提高發酵液的溶氧水平。?

步驟(3)中的柱層析是指制備型高效液相層析系統。?

假諾卡氏菌發酵生產骨化二醇的方法，步驟如下：?

（1）菌株SIIA2243依次經過三角燒瓶，種子罐，發酵罐進行深層培養發酵，以下各組分的含量均為重量體積百分比，即g/l00ml。

斜面培養：?

配制含葡萄糖1～10%，蛋白胨1～10%，玉米漿0.1～2%，氯化鈉0.1～1%，瓊脂1～2.5%，其余為水，pH6.5～7.5的培養基,121℃，30分鐘滅菌，滅菌后冷卻、制成斜面、接種，20～35℃培養5～10天。

種子培養及發酵：?

配制含蛋白胨0.2～2%，玉米漿0.2～2%，葡萄糖0.5～5%，黃豆粉0.1～1.5%，氯化鈉0.1～1.5%，磷酸二氫鉀0.1～1.5%，其余為水，pH7.0～8.0的種子培養基裝入500ml搖瓶中，冷卻后將培養好的斜面菌株挖塊接入到裝有種子培養基的搖瓶中，搖瓶轉速100～300r/min，溫度20～35℃，培養2～5天，得搖瓶種子液。