[發明專利]一種檢測孕酮的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201310584980.X
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN104655846A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 洪霞;杜霞
• 申請（專利權）人: 鎮江先創生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/31
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及獸藥殘留檢測技術領域，特別是檢測雞肉組織中孕酮的酶聯免疫試劑盒。

背景技術

孕酮亦稱為黃體酮、孕甾酮、黃體甾酮、黃體激素、助孕激素、助孕素或助孕酮是一種涉及女性月經周期、妊娠和對人類還又其他動物的胚胎有影響的類固醇。孕酮是一種女性荷爾蒙，參與人類與其他動物的雌性月經周期，支援懷孕與胚胎形成。孕酮是屬于一類稱為孕激素的荷爾蒙，也是人類最重要的孕激素。激素類藥物可提高畜食的飼料轉化率，進而達到增重的目的，但因孕酮在體內殘留會導致一系列問題，如性征變化，早熟等，對兒童和青少年作用更為明顯。目前，激素類物質已被大部分國家禁止在養殖業中使用，并不得在食品中檢出。但國內尚沒有雞肉中孕酮殘留檢測的相關報道，因此，有必要建立一種雞肉組織中孕酮殘留的檢測技術。

酶聯免疫吸附法是一種準確、可靠、快速、特異的檢測方法，適合于大批樣品的快速篩選，近年來已廣泛應用于食品安全檢測行業。本發明旨在建立一種檢測孕酮的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。

發明內容

為了克服色譜法的不足，本發明提供一種檢測孕酮的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法。該方法靈敏、準確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。

本發明檢測孕酮的酶聯免疫試劑盒，包括酶標板、孕酮標準品、孕酮抗體工作液、孕酮酶標二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液。

本發明檢測孕酮的酶聯免疫試劑盒的制備，包括以下步驟：酶標板的制備、孕酮標準品的制備、孕酮抗體工作液的制備、孕酮酶標二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮稀釋液的制備和濃縮洗滌液的制備。

其進一步特征在于：所述的酶標板經由孕酮抗原包被制備，具體步驟是將孕酮半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯得到包被抗原，用0.05?mol/L?pH?9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將孕酮包被抗原稀釋成1：40000比例，100?μL/孔，37℃避光孵育2?h，取出酶標板甩掉板內液體，加入經稀釋的濃縮洗滌液300?μL/孔，洗板2次，30?s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150?μL/孔，37℃放置1.5?h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標板放置恒溫間(25℃)晾干，抽檢合格后將酶標板真空密封于4℃條件下保存。

孕酮標準品濃度分別為0?μg/kg、0.1μg/kg、0.3?μg/kg、0.9?μg/kg、2.7?μg/kg、8.1?μg/kg。

所述孕酮抗體工作液是采用孕酮人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：60000比例制備。

所述孕酮酶標二抗工作液由酶標二抗加稀釋液稀釋成1：2000比例，所述底物液A為含有0.5?mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2?mol/L的硫酸，所述濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，為0.1?mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%?吐溫-20，0.1?mol/L的PBST，pH值范圍7.0-7.5之間。

檢測孕酮的酶聯免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯免疫反應原理，該方法包括以下步驟：

(1)預處理待測樣品，即將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，并將其復溶于樣品稀釋液中；

(2)將所需試劑從冷藏環境中取出，置于室溫（20～25℃）平衡30?min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻；

(3)取包被有孕酮抗原的酶標板，加標準品/樣本50?μL/孔到對應的微孔中，加入孕酮酶標二抗工作液，50?μL/孔，然后加入孕酮抗體工作液，50?μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25℃避光環境中反應30?min；

(4)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260?μL/孔，充分洗滌4~5次，每次間隔10?s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)；

(5)加入底物液A?50?μL/孔，底物液B?50?μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環境中反應15～20?min；

(6)加入終止液50?μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450?nm處或雙波長450/630?nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5?min內讀完數據）；