[發(fā)明專利]可在鑒別不同魚類的方法中進行應用的特異引物序列及鑒別不同魚類的DNA分子標記方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310583949.4
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103589801A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設計）人: 劉少軍;覃欽博;劉筠;王余德;王娟
• 申請（專利權）人: 湖南師范大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 湖南兆弘專利事務所 43008
• 代理人: 趙洪

1.可在鑒別不同魚類的DNA分子標記方法中進行應用的特異引物序列，包括以下的上游引物和下游引物：

上游引物：5’-GCCCGATCTCGTCTGATCTCG-3’；

下游引物：5’-GCGCTCAGGTTGGTATGGCCG-3’。

2.一種用權利要求1所述特異引物序列鑒別不同魚類的DNA分子標記方法，包括以下步驟：

（1）根據(jù)已知魚類的5S?rDNA基因保守的編碼區(qū)序列設計所述特異引物；

（2）提取待鑒別魚類材料樣本的基因組；

（3）以上述步驟（2）提取的基因組DNA為模板，設計PCR反應體系擴增其5S?rDNA基因，利用5S?rDNA基因非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的多態(tài)性通過PCR擴增反應、瓊脂糖凝膠電泳及DNA凝膠回收試劑盒純化后，獲得不同魚類待檢測樣本5S?rDNA基因的DNA片段模式；

（4）根據(jù)凝膠成像中的DNA片段模式，并與已知魚類的DNA片段模式進行比對，分析判斷出待鑒別魚類材料的種類。

3.根據(jù)權利要求2所述的DNA分子標記方法，其特征在于，在上述步驟（4）后繼續(xù)通過對DNA片段模式進行克隆測序，獲得不同魚類待檢測樣本的特異5S?rDNA基因序列；再根據(jù)擴增片段在數(shù)目和種類上的共同性和差異性，以及不同已知魚類特異的5S?rDNA基因序列，鑒定出不同魚類待檢測樣本所屬的種類以及不同魚類之間的遺傳關系。

4.根據(jù)權利要求2或3所述的DNA分子標記方法，其特征在于，所述步驟（2）的具體操作方法包括：用注射器從各待鑒別魚類材料樣本的靜脈中取血或取部分鰭條；利用DNA提取試劑盒進行各待鑒別魚類材料樣本的基因組DNA的提取。

5.根據(jù)權利要求2或3所述的DNA分子標記方法，其特征在于，所述步驟（3）中，PCR反應體系的總體積為25μl，其中含5～10?ng?DNA，1.5～2.0?mmol?MgCl₂，0.2?mmol?dNTPs，0.2～0.4?μmol正負引物，1×buffer和1.25unit?TaqTMDNA聚合酶。

6.根據(jù)權利要求2或3所述的DNA分子標記方法，其特征在于，所述步驟（3）中，PCR擴增反應的程序為：94℃預變性5min，94℃變性30?s，55℃～58℃退火30s，72℃延伸1min，25～30個循環(huán)后接著72℃10min。