[發明專利]一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體及其應用

有效

• 申請號: 201310583593.4
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN103602646A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 王宜磊;王文爽
• 申請（專利權）人: 王宜磊
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C12P19/14;C12P19/02;C12R1/885
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張貴賓

（一）技術領域

本發明涉及一種β-葡萄糖苷酶突變體，尤其涉及一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體及其應用。

（二）背景技術

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），其英文名為：beta?glucosidase，又稱β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，屬于水解酶類，能夠水解結合于末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β-D-葡萄糖和相應的配基。根據氨基酸序列的相似性和底物特異性，β-葡萄糖苷酶被劃為糖苷酶57個家族中的第一家族，該家族的顯著特征是高度的序列同源性和廣泛的底物特異性，主要是對底物的糖苷配基部分顯示出廣泛的底物特異性。

β-葡萄糖苷酶分布較為廣泛，特別是植物的種子和微生物中尤為普遍，微生物β-葡萄糖苷酶的研究主要集中在酵母、細菌、真菌和鏈霉菌中，已從多種微生物中分離得到β-葡萄糖苷酶。不同來源的β-葡萄糖苷酶的相對分子量由于其結構和組成不同而差異很大，一般在40-250kDa之間，而其可能是單亞基、雙亞基或多亞基的。多數研究結果表明，β-葡萄糖苷酶為酸性蛋白，其最適pH一般在3.0-6.0之間，許多酵母、細菌的胞內β-葡萄糖苷酶的最適pH都接近6.0。

β-葡萄糖苷酶在許多領域都有著廣泛的應用，例如：在工業上可以用于生產低聚龍膽糖，生產過程中，將高濃度的葡萄糖液用霉菌來源的β-葡萄糖苷酶進行反應，使葡萄糖發生轉移反應和縮合反應來合成低聚龍膽糖；β-葡萄糖苷酶還可以用于纖維素的降解，纖維素是葡萄糖以β-1,4-鍵結合的聚合物，為植物細胞壁的構成成分，是非常豐富的可再生資源，β-葡萄糖苷酶在纖維素水解成葡萄糖的過程中起著關鍵作用；β-葡萄糖苷酶的半乳糖酶活力可用于乳品工業來分解乳糖，可與其他酶協同作用生產葡萄糖與單細胞蛋白；β-葡萄糖苷酶還能用于改良果汁風味，其可以釋放出潛在的芳香成分，對于天然香精香料工業有著重要意義；此外，β-葡萄糖苷酶的轉糖苷活性可用于生產日化工業的非離子表面活性劑烷基糖苷，以及用于飼料工業和醫藥領域等。

目前工業上常用的瑞氏木霉來源的β-葡萄糖苷酶最適反應溫度通常在35℃左右，無法滿足高溫工業的應用，獲得最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶將具有重大意義。本發明利用來源于瑞氏木霉的β-葡萄糖苷酶，通過定點突變的方法獲得了最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶，突變體的最適反應溫度為48℃，并且具有良好的熱穩定性，其可以用于高溫條件下纖維素的降解以及食品工業等相關領域。

（三）發明內容

本發明的目的是提供一種最適反應溫度提高的β-葡萄糖苷酶突變體，以及高溫條件下該突變體在纖維素材料降解和食品工業等領域的應用。

本發明通過PCR的方法從瑞氏木霉中克隆得到了野生型的β-葡萄糖苷酶BGL1，其基因全長1455bp，編碼484個氨基酸；將其編碼基因重組到表達載體pET-32a中，在大腸桿菌BL21（DE3）中進行異源表達并純化得到重組蛋白，酶活測定結果顯示，其最適反應溫度為36℃。

為了提高BGL1的最適反應溫度，利用生物信息學分析可能會影響其最適反應溫度的氨基酸殘基，結果顯示105位Ser、273位Ile以及409位Phe可能是影響其最適反應溫度的關鍵位點，之后通過定點突變的方式，對這三個氨基酸殘基進行突變：將105位Ser分別突變為Ala和Asn，得到S105A和S105N；將273位Ile分別突變為Ala和Asn，得到I273A和I273N；將409位Phe分別突變為Ala和Asn，得到F409A和F409N；將105位Ser和273位Ile均突變為Asn，得到雙突變體S105N-I273N；對上述七個不同的突變體的酶活進行了研究，結果表明雙突變體S105N-I273N的最適反應溫度提高程度最高，達到48℃，其在45-50℃的高溫條件下均可以對底物產生較高的活性。

有益效果

本發明得到的β-葡萄糖苷酶突變體的最適反應溫度相對于野生型得到了提高，可以用于較高溫度時的纖維素材料降解以及食品、日化等領域中，為β-葡萄糖苷酶的應用提供了更多途徑的選擇，具有重要的經濟價值。

（四）附圖說明

圖1：野生型β-葡萄糖苷酶和單一位點氨基酸突變體的酶活最適反應溫度曲線；圖1A：野生型；圖1B：F409A；圖1C：F409N；圖1D：S105A；圖1E：I273A；圖1F：S105N；圖1G：I273N；