[發明專利]一種檢測托布津的化學發光酶聯免疫分析法

無效

• 申請號: 201310581873.1
• 申請日: 2013-11-20
• 公開（公告）號: CN104655844A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發明（設計）人: 洪霞;其他發明人請求不公開姓名
• 申請（專利權）人: 南京億特生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及一種酶聯免疫檢測試劑盒，尤其涉及一種托布津的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。

背景技術

托布津是一種高效、低毒、廣譜的取代苯類殺菌劑，具有內吸殺菌作用，兼有保護和治療作用，具有致癌性和致畸性，因此安全問題受到高度重視。日本農藥注冊保留標準規定米中為2?mg/kg，麥、谷類、豆類為1?mg/kg，果品、蔬菜為5?mg/kg。

目前，檢測托布津的方法主要有：放射免疫法，高效液相色譜法(HPLC)、色/質聯用分析法(LC-MS)、液/質聯用分析法(LC-MS/MS)。薄層色譜法的缺陷是：操作過程復雜，時間長；操作人員需要經過專業培訓；影響分析的干擾因素較多，結果重復性差。放射免疫法，高效液相色譜法、色/質連用分析法、液/質聯用分析法這些理化方法的缺陷是儀器設備昂貴，樣品前處理復雜，費時，費力，不易普及，檢測費用高，特別是放射免疫法還需要配備放射源，有一定危險性。鑒于此，建立一種有效、快速、簡單、靈敏的檢測托布津的方法具有重要意義。

發明內容

本發明的目的是提供一種托布津的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒。該試劑盒具有檢測靈敏度高、應用靈活、方便的特點。

本發明所述托布津的化學發光酶聯免疫檢測試劑盒，包括盒體，設在盒體內的酶標板和設在盒體內的托布津系列標準溶液、酶標羊抗兔抗體、托布津抗體、發光溶液、洗滌溶液、包被溶液及封閉溶液；其特征在于：

所述酶標板的各孔包被有以托布津與卵清蛋白偶合制成的包被抗原，其中包被抗原濃度優選10μg/mL。

所述卵清蛋白的分子量范圍優選6.7KDa~6.8KDa。

所述托布津系列標準溶液分別是0mg/kg，0.1mg/kg，0.3mg/kg，0.9mg/kg，2.7mg/kg和8.1mg/kg所述酶標羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，其工作濃度優選為1:1000。

所述托布津抗體是由托布津與分子量范圍是6.7KDa~6.8KDa的牛血清蛋白偶合制成的人工免疫原免疫動物制得的多克隆抗體，其工作濃度優選為1:1000。

所述發光液是0.01M魯米諾與0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(體積比)H₂O₂的混合液。所述魯米諾為發光底物，對甲苯酚為發光增強劑。

所述洗滌溶液是含有體積分數0.05％吐溫-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液。

所述包被溶液是每升水中含1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉的溶液，pH為9.5。

所述封閉溶液是每升洗滌溶液中含10g卵清蛋白(OVA，ovalbumin，也稱雞卵清白蛋白或雞卵白蛋白，由386aa組成，分子量約43Kd)且加入重量分數0.5％NaN₃的溶液。

本發明試劑盒最大檢測范圍為0.1mg/kg~8.1mg/kg。

本發明試劑盒中涉及的托布津標準溶液、酶標羊抗兔抗體溶液、托布津抗體溶液、發光溶液及洗滌溶液及其配方對本發明試劑盒檢測的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分及其配制方法是：

1、托布津標準溶液：以常規方法配制濃度分別為0mg/kg，0.1mg/kg，0.3mg/kg，0.9mg/kg，2.7mg/kg和8.1mg/kg的托布津標準溶液；

2、酶標羊抗兔抗體溶液：酶標羊抗兔抗體為辣根過氧化酶-羊抗兔IgG原液，使用時用洗滌溶液配制成1:1000的工作濃度；

3、托布津抗體溶液：托布津抗體是用人工免疫抗原免疫動物制得的多克隆抗體，將所得托布津抗體用洗滌溶液稀釋成1:1000的工作濃度；

4、發光溶液：是0.01M魯米諾與0.001M對甲苯酚的三(羥甲基)氨基甲烷溶液(pH＝8.8)和3/10000(體積比)H₂O₂的混合液；

5、洗滌溶液：指含有體積分數0.05％吐溫-20的pH7.5、0.1mol/L磷酸鹽緩沖液；

6、包被溶液：1.59g碳酸鈉和2.53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調節pH為9.5；

7、封閉溶液配制：10g?OVA溶于1L洗滌溶液中，再加入重量比為0.05％的NaN₃。

本發明所述酶標板的制備：

本發明所述酶標板的包被方法是采用托布津-OVA在設定的包被溶液中，以設定的濃度，在4℃中過夜反應包被。