[發明專利]一種珍珠母炮制前后寡肽的分離純化方法

無效

• 申請號: 201310581487.2
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN103554220A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 張輝;吳楠;孫佳明;高曉晨;李梅;李影;劉冬
• 申請（專利權）人: 長春中醫藥大學
• 主分類號: C07K5/083
• 分類號: C07K5/083;C07K5/072;C07K5/093;C07K5/113;C07K1/36;C07K1/16;C07K1/20;C07K1/34
• 代理公司: 長春市吉利專利事務所 22206
• 代理人: 李曉莉

技術領域

本發明屬于動物類藥材制取方法領域，特別是涉及到一種珍珠母炮制前后寡肽分離純化的方法。

背景技術

動物藥是我國醫藥學的重要組成部分，自古以來就廣泛用于防病治病。早在3250到3350年前甲骨文就記載有動物藥。《山海經》記載動物藥58種，漢代《神農本草經》記載動物藥67種，明代《本草綱目》記載440種，《本草綱目拾遺》又增收動物藥160種，歷代本草中的動物藥總數已達600多種，最多收載動物藥《中藥大辭典》達740種之多。在我國數千年的發展過程中，我們的祖先在同疾病的斗爭中，積累了極其豐富的利用動物藥防病治病的經驗。從動物藥中尋找生理活性成分，經廣泛的藥理篩選和研究開發成新藥，可以大大縮短新藥開發的周期，降低成本，從而擴大藥源。

珍珠母為蚌科動物三角帆蚌Hyriopsiscumingii(Lea)、褶紋冠蚌Cristaria?plicata(Leach)或珍珠貝科動物馬氏珍珠貝Pteria?martensii(Dunker)的貝殼，為常用中藥。主要分布于我國江蘇、浙江、湖北、安徽等地。本品始載于《開寶本草》“真珠”項下。現收載于《中國藥典》2010版一部，具有平肝潛陽，定驚明目，用于頭痛眩暈，煩躁失眠，肝熱目赤，肝虛目昏。搜集國內外文獻可知，國內外學者主要對珍珠母的微結構和晶體的形成做了研究，對其文石和方解石的研究比較多，但對珍珠母中的化學成分研究并不深入。據國內有關珍珠母化學成分的報道，珍珠母的主要成分是碳酸鈣，含有少量的微量元素和氨基酸等，對其化學成分研究還不完全，對其活性方面的研究也鮮見報道，這無疑阻礙珍珠母的進一步開發和利用。因此，為了能夠更好的應用珍珠母動物藥資源，闡明其藥效的化學依據，有必要對其化學成分和活性進行系統的研究。經過實驗研究，基本確定了珍珠母中含有寡肽類化學成分，而寡肽類化學成分正是當今社會上的研究熱點，本發明把研究珍珠母中寡肽類化學成分及其活性作為主要研究內容。據文獻報道，珍珠母的應用多為炮制品，但珍珠母炮制前后在化學成分上，特別是有效成分上的變化，卻少有報道。所以本發明對珍珠母炮制前后的活性及相應活性成分的變化做了對比分析，從而確定珍珠母炮制前后的有效成分的變化，闡述珍珠母炮制的意義。

2011年2月15日出版的《食品科學》中“合浦珠母貝肉寡肽的制備及其抗氧化活性研究”一文詳細闡述了現有技術當中以合浦珠母貝肉為原料,通過酶解技術及超濾、凝膠層析、反相高效液相色譜等分離純化技術制備具有抗氧化活性的合浦珠母貝肉寡肽。同時也說明了現有技術當中存在的局限性。

珍珠母與珍珠來源于同一動物，其成分極其相似，功效相同，炮制方法也相同。但珍珠價格昂貴，用它做藥源成本太高。珍珠母是一種廉價易得的藥材。據報道珍珠母與珍珠在有效成分上是相同的，我們可以用珍珠母代替珍珠作為中藥使用，從而節約成本，擴大藥源。本發明對珍珠母中寡肽類化學成分進行了分離純化和抗氧化活性研究，為今后充分利用及合理開發珍珠母動物藥資源提供了一定的科學依據。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是：提供一種珍珠母炮制前后寡肽分離純化的方法。

一種珍珠母炮制前后寡肽的分離純化方法，其特征在于：

步驟一、取珍珠母超微粉100目～200目生品，即準備用來進行炮制的樣品，加入蒸餾水,分數比為超微粉：蒸餾水=1:10，加熱至90℃回流提取，濾過，濾液閃蒸濃縮至濃度為65%后，凍干成粉，得到炮制后的珍珠母生品凍干粉；

步驟二、將珍珠母生品凍干粉進行SephadexLH-20凝膠柱分離，檢測得到30個流分；分別對30個流分進行薄層分析，分析結果為流分Fr.5～Fr.13的薄層顯色是相同的，將薄層顯色相同的流分Fr.5～Fr.13合并，將合并后的流分凍干成粉；

步驟三、將步驟二中得到的凍干粉上C8反相柱進行洗脫操作，并采用自動流分收集器收集，收集到波長為220nm、流速為3mL/min、5mL/管的自動接樣流分，總共收集到55個流分，色譜圖顯示有三個一樣高的小峰，對該三個一樣高的小峰進行薄層分析，分析結果顯示為陽性的流分與色譜圖相對應，為Pe-30～Pe-35，將Pe-30～Pe-35的流分合并，并將合并后的流分凍干成粉；

步驟四、對步驟三中得到的凍干粉通過反相HPLC色譜分離系統進一步分離純化,以1‰甲酸乙腈洗脫，選用VenusilASB-C18反相柱，在210nm下檢測，經反相HPLC色譜分離，選取時間為5.940min時的色譜峰，該色譜峰為寡肽1即得到珍珠母寡肽1，收集并保留寡肽1樣品，將寡肽1樣品冷凍干燥，得到寡肽1凍干粉；