[發明專利]一種快速高效的引入定點突變的方法

無效

• 申請號: 201310580830.1
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN103589748A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 肖冬光;劉廣新;董建;張翠英
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京鼎佳達知識產權代理事務所(普通合伙) 11348
• 代理人: 王偉鋒

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體地說是一種快速高效地引入定點突變的方法。

背景技術

隨著分子生物學技術滲透到生物學的各個領域，生物工作者越來越注重基因的功能研究，有目的的改變編碼特定氨基酸的堿基，獲得突變體蛋白，研究蛋白質結構與功能的關系。定點突變技術應運而生成為了基因工程操作的重要手段，同時廣泛應用于醫學領域。目前，定點突變技術常用的方法主要有三種：（1）寡核苷酸引物介導的突變，（2）PCR介導的突變，如重疊延伸PCR法，大引物法等，（3）盒式突變。基于以上方法的原理，市場上出現了用于定點突變的試劑盒，可以實現一個甚至多個位點的突變。但都在一定程度上存在操作稍繁瑣、轉化效率不高、花費昂貴的問題。

質粒為研究定點突變技術提供很好的載體，但有時僅僅游離表達是不夠的，如含有外源基因的自主復制載體不能穩定存在，克服這一缺點的方法之一就是將目的基因整合到基因組上。為了實現這個目的，我們使用很多標記基因，如銅抗性、氨芐抗性等，和一些報告基因，如氯霉素乙酰轉移酶基因(cat)、綠色熒光蛋白基因(gfp)等。這些外源基因的引入使得人們對生物的安全性及轉基因食品的安全性產生了質疑。

基于以上考慮，我們需要一種快速高效的將定點突變引入工程菌基因組且不依賴于抗生素等標記基因的方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種快速高效的定點突變的引入方法，利用盒式突變與PCR介導的突變相結合的方法獲得攜帶定點突變的質粒載體，通過兩步正向序列的同源重組成功地將定點突變引入到工業菌株，而沒有殘留任何外源堿基。

為實現上述目的，本發明提出以下技術方案：一種快速高效引入定點突變的方法，其特征在于，主要包括以下幾個步驟：

（1）根據突變堿基的位置，設計包含酶切位點的正向、反向引物，PCR擴增含有定點突變的片段；將PCR產物與YIplac211質粒同時酶切，用T4聚合酶連接；將連接體系導入DH5α感受態細胞，獲得重組質粒，酶切驗證，測序鑒定；

（2）獲得工業菌株的尿嘧啶營養缺陷型：設計正向、反向引物，從釀酒酵母（Saccharomyces?cerevisiae）W303-1a擴增突變基因ura3（乳清苷5-磷酸脫羧酶基因）,用醋酸鋰轉化法導入出發菌株，獲得其尿嘧啶營養缺陷菌株；

（3）在突變片段上選擇一個合適單一酶切位點將（1）中重組質粒線性化；運用醋酸鋰轉化法，將其導入步驟（2）獲得的營養缺陷型菌株，通過正向重復序列的第一次重組，將質粒序列整合到了基因組上，在不含尿嘧啶的完全合成培養基上篩選陽性轉化子同時菌落PCR加以驗證；

（4）將（3）得到的陽性轉化子，涂布在含5-氟乳清酸的完全合成培養基上，基因組發生第二次重組，將質粒彈出，可得到野生型菌株和定點突變的菌株；

（5）通過測序得以最終確定攜帶定點突變的菌株；

（6）用（2）中引物擴增正常的URA3基因，將其導入（5）獲得的菌株，回復其營養缺陷。

有益效果：

本發明提供了一種以URA3為遺傳標記通過正向重復序列兩次基因重組將定點突變引入到工業菌株基因組。以URA3為遺傳標記避免了傳統方法中抗性基因的使用，避免了抗生素基因在不同物種間傳播擴散的可能。正向兩次同源重組曾應用于基因的無痕敲除系統，本發明將之應用于定點突變引入到工程菌基因組，拓展其應用范圍，提供了一種將定點突變從質粒載體轉移至基因組的方法，進而實現了在基因組上完成相關定點突變的研究。

定點突變的驗證的難點在于基因組改變較少，很難驗證，本發明通過運用兩次基因重組的方法，使這一難題迎刃而解。同源重組位于基因組的特定部位，可設計特異性引物通過PCR加以驗證，可操作性強，可驗證性強。因此，本發明可廣泛應用于基因工程領域和醫學領域，推動定點突變的相關研究。

附圖說明

圖1為重組質粒YIplac211-PM的電泳驗證圖；

圖2為實施例菌株BY14aΔura3、BY14aΔura3-PM、BY14a-PM的表型驗證圖；

圖3為線性化質粒YIplac211-PM與酵母基因組兩次正向序列同源重組的流程示意圖；

圖4為轉化子BY14aΔura3-YIplac211-PM的電泳驗證圖及所用驗證引物定位圖；

圖5為第二次同源重組的轉化子BY14aΔura3-PM的測序結果比對圖。

具體實施方式