[發明專利]一種具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的構建

有效

• 申請號: 201310579783.9
• 申請日: 2013-11-19
• 公開（公告）號: CN103589719A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 薛棟升;汪江波;蔡鳳嬌;曹敬華;陳茂彬;方尚玲;鎮達
• 申請（專利權）人: 湖北工業大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865;C12R1/68
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 張火春

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技術領域

本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的構建。

背景技術

纖維素是地球上最豐富的可再生資源，地球上每年因光合作用產生的纖維素達到100億噸左右，利用纖維素生產生物能源，是緩解能源危機，實現人類可持續發展的關鍵。

纖維素利用的關鍵是把纖維素降解為可發酵性的糖類-葡萄糖。纖維素的降解需要外切酶、內切酶、葡聚糖苷酶的共同作用。其中外切酶降解晶體結構的纖維素，是纖維素降解的限速步驟。用纖維素酶降解纖維素具有綠色、條件溫和、轉化率高的特點，但是纖維素較高的生產成本成為纖維素酶降解纖維素的瓶頸。

液體發酵具有發酵體積大，易實現自動化控制等特點，被廣泛用來生產纖維素外切酶等。但是液體發酵生產的酶類產品濃度低的特征。生產的纖維素外切酶等都游離在發酵醪液中，為得到高濃度的纖維素外切酶或外切酶的固體粉末，需要對發酵醪液進行濃縮。為純化濃縮纖維素外切酶往往需要通過真空蒸發或噴霧干燥等工藝來濃縮。在纖維素蒸發濃縮或噴霧干燥的過程中，纖維素外切酶的活性喪失一部分，而且濃縮工藝大幅度提高了纖維素酶的生產成本。在蒸發或噴霧干燥的過程中，消耗大量的能源如電或燃氣等。因此濃縮成本，成為降低液體發酵生產纖維素外切酶生產成本的必然選擇。

發明內容

本發明的首要目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株。

本發明的另一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的DNA片段。

本發明的再一目的在于提供用于構建上述酵母菌株的質粒。

本發明的目的還在于提供上述酵母菌株的構建方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

用于構建具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、黑曲霉纖維素外切酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個氨基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQ?ID?NO.1～5所示。

優選的，所述的用于構建具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ?ID?NO.6所示。

用于構建具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的質粒為包含上述DNA片段的真核表達質粒。所述的真核表達質粒優選為pPIC9K質粒。

所述的用于構建具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的質粒通過包含如下步驟的方法制備得到：合成兩端有限制性內切酶識別位點含有上述DNA片段的序列，通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。所述的真核表達質粒pPIC9K質粒時，限制性內切酶優選為BglⅡ和FspAⅠ。

一種具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株，含有上述質粒。所述的酵母菌株優選為酵母菌株?SMD1168。

所述的具有生產和回收纖維素外切酶雙重功能的酵母菌株的構建方法，包括如下步驟：制備酵母電轉化感受態細胞，將上述質粒通過電轉化轉進酵母中得到。

本發明相對于現有技術具有如下優點和效果：

本發明的酵母菌株能在生產纖維素外切酶的同時，把纖維素外切酶吸收在菌株自身表面，通過簡單過濾，就能達到濃縮纖維素外切酶的目的。

???本發明大大簡化了纖維素外切酶的濃縮工藝，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此該發明具有較強的實用性。

本發明把黑曲霉（Aspergillus?niger）纖維外切酶基因在酵母內表達，并實現了煙曲霉外切酶生產和同步濃縮回收的一步完成，現有技術未有相關報道，具有較高的創新型。

本發明酵母菌株生產纖維素外切酶的回收率達到88%，發酵后外切酶的酶活達到1.5?U/g濕酵母。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。

?????實施例1

（1）pPIC9K質粒的提取

1）接1%含pPIC9K質粒的大腸桿菌細胞于2?mL?LB培養基。?

2）37?℃振蕩培養12?h。

3）取1.5?mL菌液于EP管，以4000?rpm離心3?min，棄上清液。?

4）加0.l?mL溶液Ⅰ（1%葡萄糖，50?mM?EDTA?pH?8.0，25?mM?Tris-HCl?pH?8.0）充分混合。?