[發明專利]一種培養人羊膜間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201310579708.2
• 申請日: 2013-11-19
• 公開（公告）號: CN103555663A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 操春紅;蔡鵬;余順;吳珍蘭
• 申請（專利權）人: 武漢道培胎盤干細胞生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 喬宇

技術領域

??本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種培養人羊膜間充質干細胞的方法。

背景技術

干細胞是一種未分化的細胞，有兩個基本特性，一是具有自我復制能力，二是能分化成一種以上的功能細胞，根據分化潛能的大小，干細胞一般分成三類，第一類是全能干細胞（totipotent?stem?cell），其可以分化為功能一致的全能細胞，可以發育為胎兒；第二類是多潛能干細胞（pturipotent?stem?cel)，它能夠分化為身體中的每種細胞類型，但是不能形成羊膜或胎兒發育所必需的支持組織。由于多潛能干細胞的分化潛能不是“全體”的，因此不將這種細胞稱為“全能”，而且它們不是胚胎。多潛能干細胞進一步特化為多能（multiPotent）干細胞，其專用于分化為特定功能特化的特定種系的細胞。多能干細胞能夠分化為它們所源自的組織中含有的細胞類型；例如血液干細胞只能夠分化為紅血細胞、白血細胞和血小板。胚胎干細胞（Embryonic?stem?cell）具有廣泛的潛能，能生成除羊膜外的機體所有的組織細胞；第三類是成體干細胞（aduit?stem?cell）是一種將擁有終生自我復制（identical?copies）和自我更新（self-renewal）能力的未分化細胞，它分布于不同的組織，并可演變成為各種類型的資質細胞。干細胞的分類，主要分為造血干細胞及非造血干細胞。造血干細胞主導血液、免疫方面的疾病，來源例如胎盤血；非造血干細胞則以細胞分化與修復為主，可應用于中風、糖尿病、老年癡呆等再生醫學，來源有臍帶、羊膜、乳牙等。

間充質干細胞（mesenchymal?stem?cell?MSC）是可形成多種細胞類型的多能干細胞。間充質干細胞(MSC)最早在骨髓中發現，隨后還發現存在于人體發生、發育過程的許多種組織中。鑒于間充質干細胞具有多向分化潛能、能支持造血和促進造血干細胞植入、調節免疫以及分離培養操作簡便等特點，正日益受到人們的關注。間充質干細胞的應用范圍也越來越廣泛。目前國內外已開展了多項臨床應用研究，主要疾病類型包括骨關節炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反應（GVHD），脊髓損傷及退行性神經系統疾病和糖尿病等。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種培養人羊膜間充質干細胞的方法。

為解決本發明的技術問題，本發明采用的技術方案如下：

一種培養人羊膜間充質干細胞的方法，其特征在于：它包括如下步驟：

????（1）取新鮮采集的人羊膜，清洗，放入羊膜保護液中2-8℃保存備用，所述的羊膜保護液是在AIM-V培養基中加入青霉素鈉和硫酸鏈霉素得到的，其中青霉素鈉和硫酸鏈霉素在羊膜保護液中的終濃度分別為100-200?U/mL和100-200?U?/mL；

???（2）取浸泡在羊膜保護液中不超過48小時的人羊膜，清洗，再依次置臨用新配的青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500?U?/mL和3500-4500?U?/mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50?U兩性霉素B的甲硝唑注射液中進行浸洗，最后再清洗后置于一次性無菌培養皿中進行備用；

???（3）將無菌清洗過的人羊膜剪碎，加入AIM-V培養基，置分離管中用全自動組織分離器進行分離，得羊膜組織勻漿；

???（4）將全自動組織分離器處理好的羊膜組織勻漿進行離心，棄上清，收集下層，置于培養瓶中，然后向其中加入無血清培養基，置于36-38℃、飽和濕度、體積分數為5%的CO₂孵育箱中培養，至觀察到瓶壁上形成多個大小不一、細胞數量密集的細胞島時，則獲得人羊膜間充質干細胞原代細胞混合液，然后經離心，即可獲得人羊膜間充質干細胞原代細胞，再經傳代培養至細胞融合度達80-90%即得。

??按上述方案，所述步驟（1）中的羊膜保護液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素預先溶解后再加入到AIM-V培養基（治療級)中得到的；所述步驟（2）中青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500?U?/mL和3500-4500?U?/mL的氯化鈉溶液是將注射用青霉素鈉和注射用硫酸鏈霉素按一定量加入0.9%氯化鈉注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50?U兩性霉素B的甲硝唑注射液的配制是將注射用兩性霉素B先用0.9%氯化鈉注射液溶解后，再和一定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人羊膜在青霉素鈉和硫酸鏈霉素含量分別為2500-3500?U?/mL和3500-4500?U?/mL的氯化鈉溶液和每毫升含30-50?U兩性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗時間均為8-12min。