[發明專利]一種低溫纖維素酶及其應用

有效

• 申請號: 201310578003.9
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN103589701A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 黃亦鈞;許麗紅;張青;劉艷萍;許韡;王華明
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;上海康地恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/80;C12N1/15;D06M16/00;C12R1/885
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種低溫纖維素酶及其應用。

背景技術

纖維素酶，是一種復合酶，是由多種水解酶組成的一個復雜酶系，習慣上將纖維素酶分成三類：內切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纖維素酶是在工業中應用最廣泛的酶之一，一般應用于紡織工業、去污劑工業、紙漿和造紙工業、飼料和食品工業（包括烘焙），以及用于木質纖維素材料水解，用于例如生物乙醇生產等。

纖維素酶可以按照其一級序列分類成各種糖基水解酶家族，這得到了家族一些成員的三維結構分析的支持(Henrissat1991，Henrissat和Bairoch1993，1996)。例如，糖基水解酶家族5、7、12和45含有內切葡聚糖酶。大多數紡織用酸性纖維素酶屬于家族5，而大多數紡織用中性纖維素酶為家族12或45。

大部分工業用酶通常在高于50℃的條件下才具有較高的催化效率，但是在紡織領域，為了節省能源，更為了提高織物色彩的牢固性以及減輕衣物的收縮，急需在低溫度水平（低于50℃）下仍具有良好性能的酶制劑。

發明內容

本發明為解決現有技術問題，提供了一種纖維素酶突變體及其重組表達菌株。本發明的纖維素酶突變體在低溫條件下具有更高的酶活力，可廣泛應用于紡織工業領域，效果顯著。

本發明一方面提供了一種纖維素酶突變體，是氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1的纖維素酶第48位氨基酸由Leu變為Phe，第49位氨基酸由Thr變為Lys，第55位氨基酸由Ala變為Ser，第66位氨基酸由Ala變為Pro，第83位氨基酸由Asp變為Asn，第130位氨基酸由Ile變為Val，第144位氨基酸由Gln變為His，第147位氨基酸由Leu變為Ile，第156位氨基酸由Leu變為Ile。

上述纖維素酶突變體的氨基酸序列為SEQ?ID?NO：3，其一種編碼基因的核酸序列為SEQ?ID?NO：4。

本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ?ID?NO：4的纖維素酶突變體基因的質粒。

將上述質粒轉入里氏木霉中進行重組表達，獲得的纖維素酶突變體在低溫條件下具有更高的酶活。

本發明還提供了上述纖維素酶突變體在紡織領域中的應用。

本發明的纖維素酶突變體最適作用溫度為50℃，且在40℃條件下，仍能保持70%以上的纖維素酶酶活，而野生型纖維素酶的最適作用溫度為55℃，在40℃條件下，僅能保持40%的纖維素酶酶活，與之相較，纖維素酶突變體更適合在較低溫度下發揮作用，比野生型具有更高的纖維素酶活力；本發明的纖維素酶突變體的最適作用pH為5.0，且在pH4.5-6.5范圍內均能保持80%以上的酶活水平，而野生型纖維素酶僅在pH4.5-5.5范圍內維持80%以上的酶活，與之相較，突變體的pH適應范圍更加寬泛，具有更大的應用空間。本發明的纖維素酶突變體可廣泛應用于紡織加工領域，在pH4.0-8.5范圍內應用，無需調酸可直接使用，且效果良好；除毛干凈，對織物強力損失小；牛仔水洗，起花小，花點較小的批差穩定；耐鹽性好，直接使用可用于中和除氧后的拋光、染色一浴工藝，能大大節省工時，減少生產成本。

附圖說明

圖1：里氏木霉發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指38kD處為重組表達的纖維素酶；

圖2：纖維素酶突變體與野生型相對酶活-溫度曲線圖；

圖3：纖維素酶突變體與野生型相對酶活-pH曲線圖。

具體實施方式

本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如MOLECULAR?CLONING:A?LABORATORY?MANUAL,3nd?Ed.(Sambrook,2001)和CURRENT?PROTOCOLS?IN?MOLECULAR?BIOLOGY(Ausubel,2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，這并不意味著將本發明限定于所述的任何具體方法、實驗方案和試劑，因為它們可以改變。

下面結合具體實施方式對本發明進行詳細描述。

實施例1：纖維素酶基因的克隆

1.1纖維素酶突變體的合成