[發明專利]基于液質聯用檢測膜蛋白與配體親和力的混合物篩選方法

有效

• 申請號: 201310577902.7
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN104655737B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 代書炎;蔡建華;程學恒;沈堅;姜帆;李娜;陳欣;葉志雄;任德林;張榮光;毛晨
• 申請（專利權）人: 維亞生物科技（上海）有限公司;中國科學院生物物理研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/08
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 肖愛華

1.一種基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，按如下步驟進行：

a）把純化的膜蛋白組裝到生物膜模擬系統Nanodisc中并去除去垢劑；

b）將純化、濃縮處理后的組裝有膜蛋白的生物膜模擬系統Nanodisc和化合物進行孵育處理；

c）用重復超過濾方法將與膜蛋白有非共價結合的化合物富集于過濾膜上部；

d）用液質聯用儀器檢測過濾膜上部化合物濃度來鑒定與膜蛋白有非共價結合的化合物；

其中，生物膜模擬系統是由膜支架蛋白MSP和磷脂組成的一個圓盤狀結構，膜蛋白能夠插入到磷脂雙分子層中；其中用于組裝生物膜模擬系統的膜支架蛋白MSP，包括由不同物種來源的脂蛋白改造而來的各種MSP蛋白。

2.如權利要求1所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，其中用于組裝生物膜模擬系統的膜支架蛋白MSP，包括MSP1和MSP2，以及在MSP1和MSP2基礎上改造獲得的蛋白。

3.如權利要求1所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，其中用于組裝生物膜模擬系統的磷脂，包括POPC，DMPC，DSPG，DPPC；其中膜蛋白包括G蛋白偶聯受體，離子通道蛋白，轉運蛋白；其中化合物包括片斷化合物庫，天然產物化合物庫中的化合物。

4.如權利要求3所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，其中超過濾過程包括一次超過濾，二次超過濾，三次超過濾。

5.如權利要求4所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，具體過程如下：首先，構建可以高表達A_2A腺苷受體的昆蟲表達質粒，并把該質粒在昆蟲SF9表達系統中進行高效表達，通過提膜、溶膜、過柱純化制備得到溶于去垢劑的純度高于90%的A_2A腺苷受體蛋白；隨后，將純的A_2A腺苷受體蛋白組裝到生物膜模擬體系中，并通過疏水柱去除去垢劑，得到的生物膜模擬體系，經濃縮到一定濃度后和待篩選化合物按一定比例進行混合孵育，同時，利用未組裝A_2A腺苷受體的空生物膜模擬體系作為對照；隨后，用多次超過濾方法，將與膜蛋白有非共價結合的化合物富集于超過濾管上部，將經超濾管富集后的結合有化合物的蛋白樣品經處理后，取上清用液質聯用儀器檢測其中化合物的相對含量，從而篩選出其中與蛋白有非共價結合的化合物。

6.如權利要求3或5所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，其中用液質聯用分析樣品處理過程包括：用乙腈處理使蛋白變性并與結合的化合物離解，離心使蛋白沉淀。

7.如權利要求6所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，其中超過濾過程包括將超過濾管上部的液體體積減少到起始體積的1/10，然后再加入等同減少體積的緩沖液。

8.如權利要求7所述的基于液質聯用的膜蛋白與配體親和力測定方法，其特征在于，將純的A_2A腺苷受體蛋白組裝到生物膜模擬體系中并去除去污劑的具體方法如下：選擇一個2ml的組裝體系，取預先溶解在氯仿中濃度為100mM的POPC液體110ul放到4ml的EP管中，并用氮氣緩慢吹干，使得氯仿完全揮發；待POPC準備好后，在EP管中加入400ml濃度為100mM的膽酸鈉，膽酸鈉預先溶解于20mMTris,100mMNaCl,pH7.4的緩沖液A中，60℃水浴加熱促進溶解；待POPC完全溶解后，放置在冰上冷卻，然后加入1ml濃度為4mg/ml的膜支架蛋白,并加入600ml緩沖液A使得總體積為2ml，組裝得到不含A_2A受體蛋白的Nanodisc作為空白對照；對于含A_2A腺苷蛋白的Nanodisc，則加入1mg的A_2A腺苷受體蛋白，最后用緩沖液A將總體系體積補充至2ml；將組裝混合體系于4℃孵育1小時，按照0.7g/ml濕重的比例加入預先用緩沖液A處理過的純化珠子，加入純化珠子后，將EP管放到旋轉儀上，4℃下緩慢旋轉4小時去除去污劑；組裝好后，靜置2分鐘，吸取上清，并再次加入2ml緩沖液A到純化珠子中，輕輕混勻，靜置后吸取上清，重復上述清洗過程一次，盡可能地回收Nanodisc。