[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乳酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310576790.3
• 申請(qǐng)日: 2013-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103555777A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 方柏山;嚴(yán)正平
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廈門(mén)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P7/56
• 分類(lèi)號(hào): C12P7/56;C12N11/12;C12R1/225
• 代理公司: 廈門(mén)南強(qiáng)之路專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 35200
• 代理人: 馬應(yīng)森

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及乳酸，尤其是涉及一種利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乳酸的方法。

背景技術(shù)

乳酸，學(xué)名-羥基丙酸，可按其旋光性分為L(zhǎng)型、D型和DL型。乳酸是一種十分重要的有機(jī)酸，可廣泛用于食品、制藥、紡織、印染、化妝品等領(lǐng)域。以乳酸為原料合成的聚乳酸（PLA）是一種強(qiáng)度高、可塑性強(qiáng)、環(huán)境友好的有機(jī)高分子材料，高品質(zhì)的聚乳酸可用于醫(yī)用手術(shù)縫合線、骨骼固定材料、組織缺損部位補(bǔ)強(qiáng)材料等，具有很好的生物相容性；較低品質(zhì)的聚乳酸可用于農(nóng)用大棚、一次性飯盒等，可在自然環(huán)境下被微生物降解，被認(rèn)為是極佳的塑料替代品。隨著對(duì)乳酸及其衍生物的研究越來(lái)越廣泛和深入，乳酸的需求量也隨之不斷增加。

目前，乳酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、酶催化法和微生物發(fā)酵法。化學(xué)合成法的乳酸產(chǎn)品光學(xué)純度低，且使用的原料具有很強(qiáng)的毒性；酶催化法生產(chǎn)乳酸條件苛刻、成本很高，很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸，其原料來(lái)源廣泛、能耗小、安全性好，并且可以通過(guò)菌種的選育或控制其代謝途徑來(lái)獲得高光學(xué)純度的乳酸，故微生物發(fā)酵法在世界范圍內(nèi)成為生產(chǎn)乳酸的主要方法。

21世紀(jì)，石油供需矛盾日益尖銳，石油化工及石化燃料燃燒造成的環(huán)境問(wèn)題日益突出，開(kāi)發(fā)新的對(duì)環(huán)境無(wú)害的可再生能源日益得到各國(guó)的重視。生物柴油是一種環(huán)境友好的生物燃料，在使用中可部分或全部替代石化柴油。近年來(lái)，生物柴油產(chǎn)業(yè)迅速崛起，蓬勃發(fā)展，而甘油是生物柴油生產(chǎn)過(guò)程中的主要副產(chǎn)物，每生產(chǎn)1噸生物柴油會(huì)同時(shí)產(chǎn)生0.1噸粗甘油。隨著世界范圍內(nèi)生物柴油需求量和生產(chǎn)量的迅猛增長(zhǎng)，其副產(chǎn)物粗甘油成為豐富而廉價(jià)的原料，對(duì)它的有效利用也成為緊迫的課題。同時(shí)，傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的主要原料葡萄糖、淀粉等糖質(zhì)原料的成本不斷增加，使得乳酸產(chǎn)業(yè)受到很大的原料成本壓力。因此利用廉價(jià)的粗甘油生產(chǎn)高附加值的乳酸逐漸成為新的研究方向。目前，國(guó)內(nèi)外利用微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乳酸的研究較少，其中清華大學(xué)的學(xué)者利用大腸桿菌可以以純甘油為底物發(fā)酵得到85.8g/L的乳酸（洪安安,程可可,孫燕,等.代謝甘油高產(chǎn)乳酸的菌種選育及培養(yǎng)基優(yōu)化[J].微生物學(xué)通報(bào),2009,36(8):1195-1199）。但是，運(yùn)用傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，直接以甘油作為原料發(fā)酵乳酸往往存在著底物抑制嚴(yán)重、生物量低、生產(chǎn)強(qiáng)度低等問(wèn)題，限制了微生物轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乳酸的工業(yè)化應(yīng)用。

纖維床生物反應(yīng)器（FBB）是在傳統(tǒng)填充床反應(yīng)器基礎(chǔ)上改進(jìn)設(shè)計(jì)出的一種簡(jiǎn)單、高效的生物反應(yīng)器，尤其適用于厭氧或微氧條件下的微生物固定化發(fā)酵。纖維床生物反應(yīng)器選擇棉纖維織物等纖維材料作為固定菌體細(xì)胞的基質(zhì)，具有以下優(yōu)點(diǎn)：①材料化學(xué)惰性，不會(huì)對(duì)菌體細(xì)胞有毒害作用，也不會(huì)被菌體所降解，不影響菌體在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)情況；②具有較高的比表面積和空隙率，傳質(zhì)性能良好；③單位體積可固定的細(xì)胞數(shù)量多；④價(jià)格便宜，易獲得，固定化成本低；⑤制備方法簡(jiǎn)單，適合工業(yè)放大；⑥有較好的機(jī)械強(qiáng)度，能經(jīng)受較長(zhǎng)時(shí)間的使用；⑦穩(wěn)定性好。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供可資源化利用廉價(jià)的生物柴油副產(chǎn)物粗甘油，降低乳酸發(fā)酵的原料成本，提高單位操作體積菌體密度，省去重復(fù)的菌種活化與接種等操作，提高乳酸生產(chǎn)強(qiáng)度的一種利用固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化甘油生產(chǎn)乳酸的方法。

本發(fā)明包括以下步驟：

1）將菌種接入含甘油的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；

2）將種子液接入含甘油的擴(kuò)大培養(yǎng)液，在發(fā)酵罐中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用補(bǔ)料裝置流加堿溶液將擴(kuò)大培養(yǎng)液的pH值控制在4.5～7.5的范圍內(nèi)，培養(yǎng)過(guò)程中測(cè)定培養(yǎng)液中的菌體濃度；

3）當(dāng)擴(kuò)大培養(yǎng)液中的菌體細(xì)胞濃度達(dá)到1.0～15.0g/L時(shí)，利用泵將擴(kuò)大培養(yǎng)液泵入纖維床生物反應(yīng)器內(nèi)，當(dāng)擴(kuò)大培養(yǎng)液完全充滿(mǎn)纖維床生物反應(yīng)器后，維持?jǐn)U大培養(yǎng)液在發(fā)酵罐和纖維床生物反應(yīng)器中的循環(huán)，菌體細(xì)胞固定化過(guò)程中測(cè)定擴(kuò)大培養(yǎng)液中游離菌體細(xì)胞的濃度，當(dāng)游離菌體細(xì)胞濃度降至最低點(diǎn)時(shí)，視為固定化過(guò)程結(jié)束；

4）菌體細(xì)胞固定化完成后，加入含甘油的發(fā)酵培養(yǎng)基控制初始甘油濃度為5～200g/L，或直接更換初始甘油濃度為5～200g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，進(jìn)行固定化發(fā)酵后，得到乳酸。

在步驟1）中，所述菌種為戊糖乳桿菌（Lactobacillus?pentosus）R3-8，該菌種已于2011年3月31日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，該保藏中心登記入冊(cè)編號(hào)為CGMCC?No.4726；