[發明專利]一種多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法

有效

• 申請號: 201310573895.3
• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN103571962A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 石超;馬翠萍;韓典昂;王文碩
• 申請（專利權）人: 青島科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 青島高曉專利事務所 37104
• 代理人: 張世功

1.一種多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于具體檢測過程包括以下步驟：

（1）、目標核酸與模板核酸的雜交互補：先對目標核酸通過堿基互補配對作用與模板核酸分子進行特異性雜交；

（2）、聚合酶與切刻酶協同循環擴增：聚合酶結合到目標核酸的3’端，以模板核酸為模板延伸目標核酸形成雙鏈，切刻酶作用于該雙鏈的切刻位點處，進行切刻，形成切口，聚合酶結合到該切口處，進行延伸鏈置換，聚合酶與切刻酶協同循環擴增，不斷產生產物一與產物二；

（3）、產物一與模板核酸結合進行循環擴增：將形成的產物一與模板核酸進行雜交，聚合酶以產物一3’端為起點，以模板核酸為模板進行聚合延伸，切刻酶作用于延伸形成的切刻位點處，進行切刻，形成切口，聚合酶再結合到切刻酶切刻形成的切口處，進行延伸鏈置換，聚合酶與切刻酶協同循環擴增，不斷產生產物二；

（4）、信號檢測：將步驟（2）和步驟（3）分別產生的產物二與模板核酸進行雜交，產生信號，在35-40℃恒溫條件下通過熒光檢測裝置對產生的信號進行檢測，實現核酸恒溫擴增檢測。

2.根據權利要求1所述的多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于所述的擴增為非線性級聯擴增，結果表現為類指數形式；所述的核酸為DNA或者RNA。

3.根據權利要求1所述的多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于所述的目標核酸與模板核酸互補是指目標核酸的3’端與模板完全互補，5’端完全或者不完全與模板核酸互補；或者目標核酸帶有切刻酶位點，與模板核酸中的下游切刻位點互補，目標核酸的3’端與模板完全互補，或者目標核酸的3’端與模板不完全互補，切刻酶切刻后形成的3’端與模板完全互補，目標核酸5’端完全或者不完全與模板核酸互補；目標核酸的3’端與模板核酸結合后不翹起，使聚合酶能夠結合上。

4.根據權利要求1所述的多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于所述的模板核酸結構為線性結構核酸，或為莖環結構的核酸或者修飾熒光基團與猝滅基團的分子信標，分子信標的一端標記熒光基團，熒光基團為FAM，HEX，TET，JOE，TAMRA，Cy5或者Cy3以及其它類似的熒光基團中的一種；分子信標的另一端標記猝滅基團，猝滅基團選自DABCYL，ECLIPSE，TAMRA或BHQ以及其它類似的熒光猝滅基團中的一種；分子信標有兩個或者兩個以上切刻酶位點。

5.根據權利要求1所述的多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于形成的產物一能夠與分子信標結合，聚合酶能夠在產物一的3’端延伸；產物二能夠與模板核酸穩定結合。

6.根據權利要求1所述的多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于所述的切刻酶選自Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BtsI、Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、Nt.CviPII或者其他類似的切刻內切酶中的一種；聚合酶具有鏈置換活性，選自9°NmTmDNA聚合酶、Bst?DNA聚合酶，大片段、Bsu?DNA聚合酶，大片段、Deep?VentRTm?DNA聚合酶、Deep?VentRTm（exo-）DNA聚合酶、Klenow片段3’-5’exo^-、DNA聚合酶I，(Klenow)大片段、M-MuLV反轉錄酶、phi29DNA聚合酶、DNA聚合酶、VentR(exo–)DNA聚合酶或其他類似的聚合酶中的一種；步驟（4）產生的信號為分子信標發出的熒光信號、核酸嵌插染料的信號或者類似的核酸信號。

7.根據權利要求1所述的多切刻酶位點介導的核酸恒溫擴增檢測方法，其特征在于所述熒光檢測裝置為熒光分光光度計或實時熒光熱循環儀。