[發(fā)明專利]一種油藏微生物基因組DNA提取方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201310573705.8 | 申請日： | 2013-11-15 |
| 公開（公告）號： | CN104630204A | 公開（公告）日： | 2015-05-20 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 郝濱;李彩風(fēng);曹功澤;王靜;宋欣;袁長忠;徐闖;徐鵬;王剛;曹嫣鑌 | 申請（專利權(quán)）人： | 中國石油化工股份有限公司;中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司采油工藝研究院 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 北京世譽鑫誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 11368 | 代理人： | 孫國棟 |
| 地址： | 100728 北*** | 國省代碼： | 北京;11 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 油藏 微生物 基因組 dna 提取 方法 | ||
1.一種油藏微生物基因組DNA提取方法，其特征在于以下包括步驟：
（1）有機溶劑萃取除去原油，釋放油水界面微生物
在液相樣品中加入石油醚，其與液相樣品的體積比為1：4～6，充分震蕩混合均勻后靜置1h～2h，使有機相和水相分層，取下層水相。
（2）收集菌體
將上述所得的水相，利用蠕動泵，控制壓力為0.5MPa，在0.22μm的中空纖維素膜過濾器進行過濾，收集菌體。
（3）裂解微生物細胞
首先，將上述過濾器的中空纖維素膜，剪碎與石英砂相混合，放入含有800μl～1000μl提取緩沖液的離心管中，加入450μl1xTE和50μl10mg/mL溶菌酶和10μl100mg/mL蝸牛酶，吹吸混勻，37℃孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次，其次，加入600μl裂解液，吹吸混勻，渦旋震蕩10min后，再加入30μl20mg/mL蛋白酶K，吹吸混勻，55℃孵育1h，每隔15min顛倒混勻一次，最后，4℃12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至另一個干凈的1.5mL離心管。
（4）DNA提純
首先，按照體積比為25:24:1的比例加入酚、氯仿和異戊醇，充分混勻，-20℃靜置2min，4℃12000rpm離心5min，其次，轉(zhuǎn)移上清至另一個干凈的1.5mL離心管，按照體積比為24:1的比例加入氯仿和異戊醇，充分混勻，-20℃靜置2min，4℃12000rpm離心5min，接著，轉(zhuǎn)移上清至另一個干凈的1.5mL離心管，加入1/10體積的3M醋酸鈉，加入醋酸鈉后的終體積2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，充分混勻，-20℃沉淀2h，4℃12000rpm離心10min，棄上清，在次，加入600μl預(yù)冷的70%乙醇洗滌DNA沉淀，顛倒混勻，4℃12000rpm離心5min，棄上清，最后，重復(fù)洗滌一次，吸干離心管中的殘留液體，待離心管風(fēng)干后，加入30μl無菌水和0.5μl10mg/mL的RNase?A，吹吸混勻，取3μl電泳檢測，剩余置于-20℃保存。
2.按權(quán)利要求l所述的油藏微生物基因組DNA提取方法，其特征在于所述的提取緩沖液為：Tris-Cl100mM（pH8.0），EDTA50mM，NaCl200mM，SDS2.0%（w/v），Triton?X-1000.5%（v/v）。
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