[發(fā)明專利]一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310573517.5
• 申請(qǐng)日: 2013-11-15
• 公開（公告）號(hào): CN103554252A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鄧?yán)?/a>;胡輝恒;汪模正;邵恒波
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 同路生物制藥股份有限公司
• 主分類號(hào): C07K16/06
• 分類號(hào): C07K16/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16
• 代理公司: 北京雙收知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11241
• 代理人: 王菊珍

1.一種巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于：其巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)大于等于1:400，免疫球蛋白純度大于等于總蛋白的96%。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白與正常人血清相比，主要沉淀線為IgG。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白的IgG單體及二聚體含量之和大于等于96%。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白，其特征在于：所述免疫球蛋白的劑型為液體制劑或凍干劑型。

5.權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于：包括如下步驟：

（1）用中和試驗(yàn)法篩選出巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:50的血漿原料；

（2）以篩選后的所述血漿原料制備混合血漿供試品，所述混合血漿供試品的巨細(xì)胞病毒中和抗體效價(jià)滴度大于等于1:80；

（3）將所述混合血漿供試品按低溫乙醇?jí)簽V結(jié)合層析法蛋白分離方法，分離提取免疫球蛋白組分，經(jīng)過濾、層析、超濾、病毒滅活、配置后分裝得到產(chǎn)品。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于：步驟（1）所述中和試驗(yàn)法具體包括如下步驟：

（A）樣品稀釋：

血漿樣本用細(xì)胞維持液預(yù)先進(jìn)行1：10稀釋后56℃滅活30分鐘；

打開足夠量的96孔細(xì)胞板，標(biāo)明病毒回滴用板和樣品試驗(yàn)板，并在各樣品試驗(yàn)板上標(biāo)示該板試驗(yàn)樣品的編號(hào)；

在樣品試驗(yàn)板的各樣品孔中加入40ul細(xì)胞維持液,病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔加入50μl細(xì)胞維持液；

將預(yù)先滅活的樣品液分別加入到相應(yīng)96孔細(xì)胞板的相應(yīng)位置，每孔加樣品10μl，每樣品平行做兩孔；

所述細(xì)胞維持液為體積比為5%的胎牛血清的DMEM液；

（B）攻擊病毒

制備攻擊病毒液：根據(jù)試驗(yàn)的標(biāo)本數(shù)用維持液制備足量的攻擊病毒液，將應(yīng)用病毒要稀釋到100CCID₅₀/0.05ml；除病毒回滴孔與陰性對(duì)照孔外，其余各孔中均加入50μl含100CCID₅₀的攻擊病毒液；

回滴100CCID₅₀攻擊病毒液：用細(xì)胞維持液將攻擊病毒液作10^－1、10^－2、10^－3稀釋，將攻擊病毒液與其10^－1、10^－2、10^－3濃度的病毒液加入到相應(yīng)的病毒回滴用96孔細(xì)胞板孔中，每個(gè)稀釋度加10孔，50μl/孔；

陰性對(duì)照：向陰性對(duì)照各孔中再加入50μl細(xì)胞維持液；

將所有96孔細(xì)胞板放入37℃、含有CO₂體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中和培養(yǎng)2小時(shí)；

（C）細(xì)胞懸液的配制與添加

細(xì)胞懸液的配制：取足夠量的MRC-5細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，試驗(yàn)用細(xì)胞懸液濃度應(yīng)為1×10⁵個(gè)/ml，配好的細(xì)胞液立即使用或置4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

細(xì)胞懸加：中和培養(yǎng)后每孔加細(xì)胞懸液100μl，約1×10⁴個(gè)/孔；

（D）培養(yǎng)及觀察統(tǒng)計(jì)

將完成以上操作的96孔細(xì)胞板放置37℃、含有CO₂體積百分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)11天，病毒接種后的第7天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，第9天觀察細(xì)胞病變情況，第11天最終判定結(jié)果，并記錄統(tǒng)計(jì)。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的巨細(xì)胞人免疫球蛋白的制備方法，其特征在于：步驟（3）具體包括如下步驟：

a)將所述混合血漿供試品在2℃下離心去除冷沉淀；

b)去除冷沉淀后的血漿用生理鹽水稀釋成反應(yīng)液，用pH值為4.0的醋酸緩沖液調(diào)節(jié)所述反應(yīng)液pH值至6.5，加體積百分比95%乙醇至所述反應(yīng)液中，使最終乙醇體積百分比為20%，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5℃，板框壓濾分離得沉淀；

c)將步驟b)獲得的沉淀用0℃、10倍0.01mol/L的NaCl溶液攪拌并溶解；

d)向步驟c)所得的溶解液中加體積百分比50%乙醇形成反應(yīng)液，使最終乙醇體積百分比為17%，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié)反應(yīng)液的pH值至5.1，使用冷媒控制反應(yīng)液溫度至-4.5℃，板框壓濾分離除去沉淀，收集上清液；

e)將步驟d)收集的上清液超濾透析四遍后上DEAE-Sepharose-Fast?Flow弱陰離子交換層析，反應(yīng)溫度為10℃，收集流出液；

f)將步驟e)的流出液進(jìn)行再超濾，以醋酸緩沖液調(diào)節(jié)pH值至4.0，溫度至10℃；

g)透析8遍后濃縮；

h)將濃縮后獲得的濃縮液用2mol/L的冰醋酸調(diào)pH至3.85，加入質(zhì)量百分比為30%的麥芽糖使最終濃度在10%作為保護(hù)劑，補(bǔ)加生理鹽水使蛋白質(zhì)量百分含量為5.8%，得到原液；

i)將所述原液在24～25℃下孵放21天后用納米膜過濾的雙病毒滅活處理；

j)無菌分裝后得到產(chǎn)品。