[發明專利]雞白介素-10單克隆抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201310572486.1
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103571796A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 韓凌霞;廉傳江;文輝強;司昌德;林歡;陳洪巖
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所;哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/24;G01N33/68;G01N33/577;C07K14/54;C07K1/22
• 代理公司: 北京康思博達知識產權代理事務所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術領域

本發明涉及單克隆抗體，尤其涉及雞白介素-10單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發明進一步涉及該單克隆抗體在檢測或純化雞白介素-10蛋白中的應用，屬于雞白介素-10單克隆抗體的制備及應用領域。?

背景技術

白細胞介素簡稱白介素，是由白細胞產生的、介導細胞間相互作用的細胞因子，在細胞的活化、增殖和分化中起調節作用。隨著分子生物學的發展，有關雞白介素基因和功能的研究已逐漸成為熱點，從雞中分離出多種白介素，能夠應用于免疫治療劑、免疫增強劑、構建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等細胞因子增強或調節機體的非特異性免疫，不僅會有效防控畜禽疾病，還能在畜牧業生產中產生巨大的經濟效益。?

目前，用于分泌雞白介素-10單克隆抗體的雜交瘤細胞株存在效價低、穩定性差等缺陷，所分泌的單克隆抗體特異性較差，嚴重制約了生產應用，亟待改進。?

發明內容

本發明的目的之一是提供一株穩定、高效分泌雞白介素-10單克隆抗體的雜交瘤細胞株；?

本發明的目的之二是提供由該雜交瘤細胞株分泌的雞白介素-10單克隆抗體；?

本發明的目的之三是將所述的雞白介素-10單克隆抗體應用于檢測或純化雞白介素-10蛋白。?

本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的：?

一株穩定、高效分泌雞白介素-10單克隆抗體的雜交瘤細胞株CHIL-10?2F6，其微生物保藏編號為：CGMCC?NO.7657；分類命名為：雞IL-10單克隆抗體雜交瘤細胞株；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2013年5月29日：保藏地址：中國北京朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。?

本發明以原核表達的重組蛋白ChIL-10為免疫原，真核細胞系表達的ChIL-10F和ChIL-10M蛋白為篩選原，細胞融合后以IFA篩選雜交瘤細胞上清，將初步判定為陽性的雜交瘤細胞經2次克隆化，獲得3株分泌ChIL-10單抗的細胞株：2F6，3E6和3C12。本發明用IFA檢測3株分泌ChIL-10單抗的細胞株培養上清，測定這3株陽性雜交瘤細胞株的效價，從效價測定結果來看，2F6陽性雜交瘤細胞株的單抗腹水IFA效價為1：2800，3E6陽性雜交瘤細胞株的單抗腹水IFA效價為1：1300，3C12陽性雜交瘤細胞株的單抗腹水IFA效價為1：1200；從效價測定結果來看，2F6陽性雜交瘤細胞株的單抗腹水IFA效價要顯著高于其它2株陽性雜交瘤細胞株的單抗腹水IFA效價。?

本發明將陽性雜交瘤細胞株2F6、3E6和3C12所分泌的單克隆抗體分別與原核重組蛋白ChIL-10進行Western?blot，試驗結果發現，2F6陽性雜交瘤細胞株的單抗只與重組蛋白ChIL-10起反應，而不與空載體菌體反應，說明2F6陽性雜交瘤細胞株的單抗的特異性最好；陽性雜交瘤細胞株3E6和3C12所分泌的單克隆抗體與空載體菌體存在反應，特異性較差。?

本發明應用雜交瘤細胞株2F6所分泌的單克隆抗體檢測經LPS刺激的外周血淋巴細胞中的IL-10蛋白，試驗結果發現，不同B單倍型雞的外周血淋巴細胞中均檢測到一條17kDa大小的蛋白，檢測到的蛋白均與天然ChIL-10蛋白17kDa相符。?

本發明雞白介素-10單克隆抗體具有良好的特異性，可制備成檢測或診斷雞體內的IL-10蛋白的診斷試劑，例如，可以將本發明雞白介素-10單克隆?抗體制備成診斷或檢測IL-10蛋白的ELISA檢測試劑盒。?

此外，本發明雞白介素-10單克隆抗體還可應用于純化雞白介素-10蛋白；例如，將本發明單克隆抗體吸附在惰性的固相基質上制備成層析柱；當樣品流經層析柱時，待分離的抗原與固相的單克隆抗體發生特異性結合，其余成分不能與之結合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到純化的雞白介素-10蛋白。?

附圖說明

圖1單克隆抗體亞類的鑒定結果；分別為2F6、3E6，3C12的細胞培養液的上清。?

圖2腹水的IFA反應結果(200×)；A：腹水稀釋50倍時的IFA結果；B：腹水稀釋2000倍時的IFA結果；C：陰性對照。?

圖3單抗與原核重組蛋白ChIL-10的Western?blot的結果；1：原核重組蛋白ChIL-10；2：空載體菌體；M：蛋白質分子質量標準。?

圖4利用單抗2F6檢測經LPS刺激的雞外周血淋巴細胞中的IL-10蛋白結果；1-2：兩只雞個體；M：蛋白質分子量質量標準。?