[發(fā)明專利]雞白介素-18單克隆抗體及其制備方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310572459.4
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103589690A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓凌霞;文輝強;廉傳江;司昌德;林歡;陳洪巖
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所;哈爾濱動物生物制品國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: C12N5/20
• 分類號: C12N5/20;C07K16/24;G01N33/68;G01N33/577;C07K14/54;C07K1/22;C12R1/91
• 代理公司: 北京康思博達知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11426
• 代理人: 余光軍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及雞白介素單克隆抗體，尤其涉及雞白介素-18單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發(fā)明進一步涉及該單克隆抗體在檢測或純化雞白介素-18蛋白中的應(yīng)用，屬于雞白介素-18單克隆抗體的制備及應(yīng)用領(lǐng)域。?

背景技術(shù)

白細胞介素簡稱白介素，是由白細胞產(chǎn)生的、介導(dǎo)細胞間相互作用的細胞因子，在細胞的活化、增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，有關(guān)雞白介素基因和功能的研究已逐漸成為熱點，迄今為止，已從雞中分離出多種白介素，例如：IL-1、IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IL-16、IL-18等，這些白介素能夠應(yīng)用于免疫治療劑、免疫增強劑、構(gòu)建新型基因工程疫苗等方面，利用白介素等細胞因子增強或調(diào)節(jié)機體的非特異性免疫，不僅會有效防控畜禽疾病，還能在畜牧業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。?

目前，用于分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株存在效價低、穩(wěn)定性差等缺陷，所分泌的單克隆抗體特異性較差，嚴重制約了生產(chǎn)應(yīng)用，亟待改進。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是提供一株穩(wěn)定、高效分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株；?

本發(fā)明的目的之二是提供由該雜交瘤細胞株分泌的雞白介素-18單克隆抗體；?

本發(fā)明的目的之三是將所述的雞白介素-18單克隆抗體應(yīng)用于檢測或純?化雞白介素-18蛋白。?

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：?

一株穩(wěn)定、高效分泌雞白介素-18單克隆抗體的雜交瘤細胞株CHIL-184E11，其保藏編號為：CGMCC?NO.7658；分類命名為：雞IL-18單克隆抗體雜交瘤細胞株；保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏時間是2013年5月29日：保藏地址：中國北京朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所。?

本發(fā)明以原核表達的重組蛋白ChIL-18為免疫原，真核細胞系表達的ChIL-18F蛋白為篩選原，細胞融合后以IFA篩選雜交瘤細胞上清，將初步判定為陽性的雜交瘤細胞經(jīng)2-3次克隆化，獲得8株分泌ChIL-18單抗的細胞株：2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11。本發(fā)明用IFA檢測8株分泌ChIL-18單抗的細胞株培養(yǎng)上清，測定這8株陽性雜交瘤細胞株的效價；4E11效價為1:3200，2G7、2G8、3E5、5D3、1E8、2C4和2D11的效價分別為1:1800、1:1600、1:1900、1:1700、1:2000、1:1400和1:1300。從檢測結(jié)果來看，4E11單抗腹水效價要遠遠高出其它7株雜交瘤細胞株單抗效價。?

本發(fā)明將陽性雜交瘤細胞株2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11所分泌的單克隆抗體分別與原核重組蛋白ChIL-18進行Western?blot，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性雜交瘤細胞株4E11的單抗只與重組蛋白ChIL-18起反應(yīng)，而不與空載體菌體反應(yīng)，說明陽性雜交瘤細胞株4E11分泌的單抗特異性最好；陽性雜交瘤細胞株2G7、2G8、3E5、5D3、1E8、2C4和2D11所分泌的單克隆抗體與空載體菌體存在反應(yīng)，特異性較差。?

本發(fā)明雞白介素-18單克隆抗體具有良好的特異性，可制備成檢測或診斷雞體內(nèi)的IL-18蛋白的診斷試劑，例如，可以將本發(fā)明雞白介素-18單克隆抗體制備成診斷或檢測IL-18蛋白的ELISA檢測試劑盒。?

此外，本發(fā)明雞白介素-18單克隆抗體還可應(yīng)用于純化雞白介素-18蛋白；例如，將本發(fā)明單克隆抗體吸附在惰性的固相基質(zhì)上制備成層析柱；當(dāng)?樣品流經(jīng)層析柱時，待分離的抗原與固相的單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合，其余成分不能與之結(jié)合。將層析柱充分洗脫后，改變洗脫液的離子強度或pH，欲分離的抗原與抗體解離，收集洗脫液便可得到純化的雞白介素-18蛋白。?

附圖說明

圖1單克隆抗體亞類的鑒定結(jié)果；1-8：分別為2G7、2G8、3E5、4E11、5D3、1E8、2C4和2D11的細胞培養(yǎng)液的上清。?

圖24E11腹水的IFA反應(yīng)結(jié)果(100×)；A：腹水稀釋50倍時的IFA結(jié)果；B：腹水稀釋3000倍時的IFA結(jié)果；C：陰性對照。?

圖3單抗與原核重組蛋白ChIL-18的western?blot的結(jié)果；1：原核重組蛋白ChIL-18；2：未誘導(dǎo)菌；M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準。?

圖4雞脾臟中的IL-18蛋白檢測結(jié)果；1-5：不同個體雞脾臟；M：蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準。?

具體實施方式