[發明專利]單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒及應用

無效

• 申請號: 201310571311.9
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103602739A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 陳健舜
• 申請（專利權）人: 浙江省水產技術推廣總站
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;王兵

1.一種單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括凍存管和PCR反應管，所述凍存管包括凍存管A、凍存管B、凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F和凍存管G，所述凍存管A裝有用于PCR反應的Taq?DNA聚合酶、10×buffer、dNTP?mixture和引物的混合液制備的凍干粉，凍存管B裝有裂解液，凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F分別裝有單增李斯特菌1/2a型陽性對照緩沖液、單增李斯特菌1/2b型陽性對照緩沖液、單增李斯特菌1/2c型陽性對照緩沖液、單增李斯特菌4b型陽性對照緩沖液，凍存管G裝有稀釋液，所述稀釋液為雙蒸水；所述凍存管A中引物的序列為：

L1-F：AGCAAAATGCCAAAACTCGT

L1-R：CATCACTAAAGCCTCCCATTG

L2-F：AGTGGACAATTGATTGGTGAA

L2-R：CATCCATCCCTTACTTTGGAC

L3-F：AGGGCTTCAAGGACTTACCC

L3-R：ACGATTTCTGCTTGCCATTC

L4-F：AGGGGTCTTAAATCCTGGAA

和L4-R：CGGCTTGTTCGGCATACTTA。

2.如權利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于所述PCR反應管為100～300個。

3.如權利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于所述凍存管A內的凍干粉是將凍存管A內所述混合液先在-80℃預凍10h，再在-40℃持續凍干30h，然后以1.5℃/min的速率升溫至25℃干燥2h使水分含量達到5%以下，獲得凍干粉；所述每8μL混合液組成為：Taq?DNA聚合酶0.4μL，10×buffer3μL，dNTP?mixture0.6μL，濃度均為50μM的L1-F、L1-R、L2-F、L2-R、L3-F、L3-R、L4-F和L4-R引物各0.5μL，所述dNTP?mixture由終濃度均為10mM的dATP、dCTP、dGTP和dTTP構成。

4.如權利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于凍存管B中所述裂解液終濃度組成為：體積濃度4%Triton-X100，5mg/mLNaN₃，1mol/L?Tris，pH為8.0，溶劑為蒸餾水。

5.如權利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒，其特征在于每個試劑盒有100個PCR反應管，所述凍存管A內凍干粉的量以凍干前混合液的體積計為800μL，所述凍存管B內裝有裂解液1mL，凍存管C、凍存管D、凍存管E、凍存管F各自裝有陽性對照緩沖液0.5mL，凍存管G裝有1.5mL稀釋液。

6.一種利用權利要求1所述單增李斯特菌主要血清型快速分型試劑盒進行單增李斯特菌主要血清型分型的方法，其特征在于所述分型方法按如下步驟進行：（1）將凍存管G中稀釋液加至凍存管A，重懸、混勻制成混懸液，存放于-20℃備用；所述凍干粉用量以凍干前混合液體積計，所述的凍存管G中稀釋液與混合液體積比為15:8；（2）將凍存管B中的裂解液分別加入PCR反應管，分為對照PCR反應管和待檢PCR反應管，再依次將凍存管C、凍存管D、凍存管E和凍存管F中的陽性對照緩沖液加入相應對照PCR反應管內，將待檢樣品加入待檢PCR反應管，分別混合均勻，然后再向各個PCR反應管內加入步驟（1）凍存管A內的混懸液，立即進行PCR擴增；所述待檢樣品為待檢的單增李斯特菌接種在BHI培養基中，37℃培養過夜后，取菌液100℃煮沸滅活后離心棄去上清液，取沉淀用雙蒸水重懸，制成待檢樣品；所述凍存管B中裂解液與凍存管A中混懸液的體積比為2:3，所述凍存管B中裂解液與凍存管C、凍存管D、凍存管E和凍存管F中的陽性對照緩沖液的體積比均為2:1，所述凍存管B中裂解液與待檢樣品體積比為2:1；

（3）將步驟（2）各個PCR反應管按以下反應條件在PCR儀上進行擴增：95℃預熱3min；95℃變性45s，55℃退火30s，72℃延伸55s，25個循環；72℃保持5min；

（4）將步驟（3）擴增后的產物分別在質量濃度1%瓊脂糖凝膠與0.5×TBE緩沖液中電泳，經Goldview染色后用凝膠成像系統讀取數據并記錄；

（5）結果判定：檢測后，待檢樣品與凍存管C內的陽性對照溶液同時擴增出691bp條帶的為單增李斯特菌1/2a型陽性；待檢樣品與凍存管D內陽性對照溶液同時擴增出471bp條帶的為單增李斯特菌1/2b型陽性；待檢樣品與凍存管E內陽性對照溶液同時擴增出691bp、906bp兩條條帶的為單增李斯特菌1/2c型陽性；待檢樣品與凍存管F內陽性對照溶液同時擴增出471bp、597bp兩條條帶的為單增李斯特菌4b型陽性；陽性對照溶液出現條帶而待檢樣品無條帶的為非單增李斯特菌主要血清型；待檢樣品與陽性對照溶液均無條帶或待檢樣品出現條帶而陽性對照溶液無條帶的需重新檢測并判定。