[發(fā)明專利]一種灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性快速檢測方法

無效

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• 申請日: 2013-11-18
• 公開（公告）號: CN103558375A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 王利華;羅光華;張月亮;姚靜;方繼朝
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業(yè)科學院
• 主分類號: G01N33/544
• 分類號: G01N33/544
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一、技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及利用硝酸纖維素膜和3種溶液快速檢測灰飛虱對有機磷殺蟲劑的抗性。

二、技術背景

灰飛虱Laodelphax?striatellus?Fallèn是我國重要水稻害蟲之一，在所有稻區(qū)均有發(fā)生。除以成蟲、若蟲直接刺吸危害水稻、小麥外，還傳播水稻條紋葉枯病、黑條矮縮病等多種植物病毒病，其傳毒危害造成的損失巨大，嚴重時甚至顆粒無收，治蟲防病成為挽回損失的主要手段。

灰飛虱的防治一直以化學農藥為主，有機磷農藥是害蟲防治中常用的一類農藥。我國灰飛虱防治最常用的有機磷農藥為毒死蜱。毒死蜱(英文通用名稱Chlorpyrifos，化學分子式C9H11C13NO3PS)屬于膽堿酯酶抑制劑，是一種高效、廣譜、安全的有機磷殺蟲、殺螨劑。具有良好的觸殺、胃毒和熏蒸作用以及強內吸性和高殺蟲活性，可防治多種害蟲，與常規(guī)有機磷農藥相比毒性低，使用安全，是農業(yè)部推薦的用于灰飛虱防治的主要藥劑之一。但是由于生物對逆境具有一定的進化適應性，抗藥性的產生是殺蟲劑使用的必然代價。抗性檢測表明浙江省嘉興、寧波和湖州地區(qū)，江蘇省通州、楚州、大豐、南京和蘇州地區(qū)灰飛虱對毒死蜱產生了低水平抗性。江蘇省句容、建湖和武進地區(qū)、安徽廬江、福建福州和廣東廣州等地灰飛虱對毒死蜱產生了中等水平的抗性。抗性機理研究結果證實酯酶活性上升是促進灰飛虱對機磷殺蟲劑產生抗性的重要因子。

抗性水平的監(jiān)測是制定綜合防治措施，有效治理害蟲的先決條件。有3種方法可以檢測害蟲對殺蟲劑是否產生抗性，即生測法、生化法和分子檢測法。生測法為傳統(tǒng)的抗性檢測方法，該方法可以得到害蟲對殺蟲劑的抗性倍數(shù)，但是存在兩方面的問題。一是所需時間長，完成整個生測需要2-5天，但是害蟲發(fā)育較快，一般2天即可發(fā)育到下一齡期，因此在得到生測結果后有可能錯過最佳防治時期。二是需要花費大量的人力。分子檢測法源于分子生物學的發(fā)展，該方法要求明確殺蟲劑抗性靶標基因和相關突變，對非靶標抗性難以檢測，而害蟲抗性發(fā)展的一般規(guī)律是先產生代謝抗性，然后再產生靶標抗性，因此靶標抗性一般與高水平抗性有關，在產生低水平抗性時，其靶標基因突變頻率極低，難以檢測。生化法根據(jù)害蟲抗性產生機理，測定相關代謝酶的活性，從而判斷害蟲是否產生抗性，可以檢測較低水平的抗性。傳統(tǒng)生化檢測，需要在田間收集試蟲，然后在室內用酶標儀測定，因此對檢測人員在技術上有一定的要求。本發(fā)明即源于該方法，但是借鑒了酶聯(lián)免疫法的優(yōu)點，采用硝酸纖維素膜為載體，可以快速簡單地檢測試蟲是否對有機磷殺蟲劑產生抗性，對操作人員要求低。

2、技術方案

為達到快速簡單檢測有機磷殺蟲劑抗性的目的，本發(fā)明借鑒酶聯(lián)免疫斑點法的優(yōu)點，將酯酶固定在硝酸纖維素膜上，然后通過染色和漂洗，根據(jù)染色后斑點的顏色判斷灰飛虱是否對有機磷殺蟲劑產生抗性，具有快速簡單的優(yōu)勢。

本發(fā)明為一種快速檢測灰飛虱有機磷殺蟲劑抗性的方法，由硝酸纖維素膜、磷酸緩沖液、染色液等組成。

3、有益效果

本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，可以產生以下效果：

(1)快速：生物測定方法測定試蟲對殺蟲劑的抗性一般需要48-120小時才能得到結果，而該方法只需要1小時即可判斷試蟲對有機磷殺蟲劑是否產生抗性。

(2)操作簡單，且對操作人員要求低：不管是傳統(tǒng)的生測法、生化法還是分子檢測法都要求操作人員有相關的專業(yè)背景，需要受過相關的專業(yè)培訓，而且相關檢測工作較繁瑣并需要有相應的儀器設備。而本發(fā)明只需適量硝酸纖維素膜，再配合3種不同的溶液即可完成對樣本的檢測，因此操作簡單，對操作人員的專業(yè)素質要求較低，只需簡單培訓，就能進行相關檢測工作。

(3)靈敏性高：與分子檢測技術相比可以檢測更低水平的抗性。

四、具體實施方式

試劑：

溶液A：PH7.5磷酸鈉緩沖液。

溶液B：PH6.0磷酸鈉緩沖液。

溶液C：α-乙酸萘酯、固藍RR鹽溶于PH6.0磷酸鈉緩沖液。

硝酸纖維素膜

酯酶活性檢測：

取試蟲置于離心管中，然后加入溶液A，勻漿棒研磨均勻。取0.5μl酶液，滴在硝酸纖維素膜上，晾干。然后將晾干后的硝酸纖維膜浸在溶液C中5min，取出膜，用溶液B漂洗2min，取出后即觀察顏色，以敏感品系為標準，比較斑點顏色的深淺判斷試蟲是否產生抗性。

實施例1：

取毒死蜱抗性試蟲5頭，研磨后，將酶液等比例稀釋，共6個濃度，然后進行染色。結果如附圖1。根據(jù)該結果可知硝酸纖維素膜染色的深淺與酯酶的含量呈正比。

實施例2：