[發明專利]一種固定赤霉菌生物轉化制備煙酸的包埋-交聯方法

無效

• 申請號: 201310570085.2
• 申請日: 2013-11-16
• 公開（公告）號: CN103627745A
• 公開（公告）日: 2014-03-12
• 發明（設計）人: 許正宏;楊濤;李恒;陸震鳴;史勁松;錢建瑛;孫文敬;周強
• 申請（專利權）人: 江南大學;江西省德興市百勤異Vc鈉有限公司
• 主分類號: C12P17/12
• 分類號: C12P17/12;C12N11/10;C12N11/08;C12N11/04;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種利用京尼平交聯聚乙烯醇-殼聚糖復合材料固定化腈水解酶產生菌---赤霉菌CA3-1（Gibberella?intermedia,CGMCC?No.4903）生物制備煙酸的方法，屬于生物工程應用技術領域。

背景技術

煙酸，化學名稱吡啶-3-甲酸，又名尼古丁酸，是一種動物所必需的化學物質，它參與有機物的氧化還原作用，在日常生活中被廣泛應用。煙酸也是一種重要的醫藥原料和化工中間體。利用煙酸可以合成許多治療各種皮膚性疾病、高血壓癥狀和冠心病等的藥物。也可作為藥物中間體用于異煙肼等藥物的生產，同時廣泛用于發光材料、染料、飼料等。煙酸在人體內具有維持神經和皮膚健康、擴張血管、促進消化功能的作用。

生物轉化制備煙酸是在溫和的條件下進行的，催化活性高，反應過程易于控制，底物選擇性強。這與傳統的化學法生產煙酸相比，提高了生產效率、節約大量能源、減少廢氣廢渣的產生量、降低了生產成本。

固定化細胞的轉化活力因受到固定化過程的影響而有所降低，但固定化細胞的優勢在于：固定化細胞容易回收重復利用，有利于產物的分離純化，而且降低了生產成本，提高了單位利用效率。這一點是游離細胞所無法媲美的。因此，選擇合適的固定方法和固定化材料制備殘留活性高、能多次重復利用、儲存和操作穩定性好的固定化細胞前景值得期待。

固定化分為單一材料和復合材料固定；傳統固定化方法一般采用單一材料進行固定。復合材料固定化細胞則能夠彌補單一材料固定化細胞難以同時兼有良好機械強度和高殘留活力的劣勢。本專利使用聚乙烯醇-殼聚糖復合材料包埋固定化赤霉菌CA-1，獲得了較好的機械強度和保留活力。先包埋固定，而后經過交聯劑處理，是進一步提高固定化細胞的機械強度的一種方法。現在主要代表性交聯劑有傳統交聯劑戊二醛和生物交聯劑京尼平。京尼平（Genipin）是梔子苷經β-葡萄糖苷酶水解后的產物,是一種優良的天然生物交聯劑，可以與蛋白質、膠原、明膠和殼聚糖等交聯制作生物材料。京尼平的毒性是傳統交聯劑（戊二醛等）的1/10000左右，大大降低了固定化細胞在交聯過程中對細胞的損傷。戊二醛是一種雙功能交聯劑，其含有的醛基可以與羥基和氨基反應，從而起到交聯作用，得到網狀凝膠。戊二醛毒性大，在微生物固定化過程中會對其活性造成巨大損傷。

吳國杰等在《殼聚糖-聚乙烯醇的硬度研究》中得出結論聚乙烯醇-殼聚糖凝膠硬度隨著聚乙烯醇與殼聚糖質量比和交聯劑戊二醛濃度的增大而增大，證明利用戊二醛交聯增加固定化細胞機械強度是可以實現的。在專利《一種京尼平交聯大豆蛋白基茶葉堿控釋膠囊制劑及其制備方法》中，以京尼平為交聯劑，制備了表面光滑，內部致密的凝膠。具有無毒，穩定的三維網絡結構。使得藥物穩定性明顯提高。在《生物交聯劑京尼平交聯牛心包生物支架材料的性能》一文中認為，京尼平交聯比戊二醛交聯效果具有更好生物相容性，交聯效果好，是較好的交聯方法。京尼平在生物材料領域應用較多，利用京尼平交聯制備生物相容性好，毒性低的生物組織和生物骨骼。

本專利使用聚乙烯醇-殼聚糖復合材料固定赤霉菌CA3-1，并且分別使用戊二醛和生物交聯劑京尼平對固定化細胞進行交聯大幅提高其強度。利用京尼平進行固定化細胞的制備，這是首次報道。本專利使用京尼平交聯的固定化細胞，很好的解決了固定化細胞重復利用次數少，交聯處理后固定化細胞保留活力低等突出的問題，更好發揮固定化細胞的優勢。

發明內容

本發明目的是提供一種京尼平交聯復合材料固定化赤霉菌CA3-1（Gibberella?intermedia,?CGMCC?No.?4903）生物制備煙酸的方法。

本發明的技術方案為：赤霉菌CA3-1通過液體培養獲得菌液，經過離心分離獲得濕菌體，用生理鹽水離心洗滌數次后重懸于生理鹽水中，分別與聚乙烯醇和殼聚糖的混合包埋材料溶液、海藻酸鈉和明膠混合包埋材料溶液混合均勻后分別用注射器平穩的注入到含多聚磷酸鈉的飽和硼酸溶液、氯化鈣溶液中固化，得到的固定化小球經過濾、用PBS洗去表面未固定的細胞和固化溶液。1、戊二醛交聯固定化細胞的制備：取定量的固定化細胞加入到含有戊二醛的PBS緩沖液中交聯處理一定時間，交聯結束后用生理鹽水反復洗滌固定化細胞，除去殘余戊二醛。2、京尼平固定化細胞的制備：取定量的固定化細胞加入到含有京尼平的PBS緩沖液中，在一定溫度下下處理一段時間，結束后用PBS緩沖液反復洗滌數次，除去殘余京尼平。取定量的固定化小球參與反應，加入PBS緩沖液，加底物3-氰基吡啶，在一定溫度、一定pH值的條件下反應一定時間后，得到產物煙酸。