[發(fā)明專(zhuān)利]一株反硝化細(xì)菌及其培養(yǎng)條件

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310568985.3
• 申請(qǐng)日: 2013-11-15
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103555637A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張旦旦;竇文芳;史勁松;許正宏
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C02F3/34;C12R1/38
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株反硝化細(xì)菌及其培養(yǎng)方法，以及其反硝化能力。

背景技術(shù)

水體富營(yíng)養(yǎng)化是現(xiàn)今我國(guó)水環(huán)境面臨的重大問(wèn)題，嚴(yán)重地阻礙著我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。廢水處理過(guò)程中的脫氮處理越來(lái)越顯示其重要地位。在現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，由于養(yǎng)殖動(dòng)物排泄和餌料過(guò)剩等原因造成水體中氨氮、亞硝酸鹽等的含量嚴(yán)重超標(biāo)，水質(zhì)惡化，進(jìn)而導(dǎo)致病害頻發(fā)，并嚴(yán)重影響了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。相對(duì)于物理化學(xué)脫氮方法，生物脫氮已經(jīng)成為廢水中去除氮素污染的最有效的方法之一，而微生物的反硝化作用正是改善水質(zhì)，特別是降低水體中亞硝酸鹽濃度的有效手段之一。

本發(fā)明的目的在于提供一株反硝化細(xì)菌及其培養(yǎng)條件，并初步研究其反硝化能力，可應(yīng)用于水體的凈化工藝。

發(fā)明內(nèi)容

反硝化細(xì)菌的篩選、鑒定與培養(yǎng)條件優(yōu)化方法如下：

（1）平板初篩及反硝化能力初步鑒定：從江南大學(xué)湖邊采集土壤樣品，制備土壤懸液，涂布于DM固體平板，于30℃恒溫培養(yǎng)至長(zhǎng)出明顯菌落，用接種環(huán)逐個(gè)挑取形態(tài)各異的菌落至新的DM固體平板，劃線分離出單菌落。選取分離后的單菌落，點(diǎn)種于BTB平板上，挑取有藍(lán)色變色圈的陽(yáng)性菌株即為反硝化細(xì)菌。

（2）搖瓶復(fù)篩與脫氮能力測(cè)定：初篩得到的菌株經(jīng)搖瓶發(fā)酵，測(cè)定其脫氮能力。經(jīng)復(fù)篩，3號(hào)菌總氮去除率最高，達(dá)78%。

（3）菌株16S?rDNA鑒定：提取總DNA，用細(xì)菌16S?rDNA通用引物擴(kuò)增，得到的基因序列為1500?bp，經(jīng)測(cè)序比對(duì)，為黃色海假單胞菌（Pseudomonas?xanthomarina），命名為DN1，于2013年5月29日保藏在位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC?No.?7650。

（4）菌株發(fā)酵條件初步優(yōu)化：利用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最適培養(yǎng)基配方為丁二酸鈉6-8?g/L、酵母粉6-10?g/L、硝酸鈉0.67?g/L、磷酸二氫鉀1.36?g/L、硫酸銨0.24?g/L、硫酸鎂0.2?g/L，搖床培養(yǎng)條件為：pH?5.0，30℃，200?rpm，該條件下發(fā)酵14h，OD₆₀₀達(dá)7.29，約3×10⁸?cfu/ml。

（5）反硝化能力測(cè)定：在NaNO3濃度為10?mmol/L的水體中，添加丁二酸鈉4?g/L，按1%的量接入上述菌液，72h后檢測(cè)水樣中硝酸鹽氮和亞硝酸鹽氮含量（以不投加菌體的水樣作為對(duì)照），計(jì)算脫氮率達(dá)到90%以上。

?其中步驟（1）中所述的DM培養(yǎng)基為（g/L）：丁二酸鈉?4.72，NaNO₃?0.67，KH₂PO₄?1.50，Na₂HPO₄?0.42，MgSO₄·7H₂O?1.00，微量元素溶液?2?ml，pH調(diào)至7.2，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂；BTB平板培養(yǎng)基為（g/L）：FeCl₃·H₂O?0.5，琥珀酸鈉8.5，BTB?1?ml（1%溶于酒精），KNO₃?1.00，KH₂PO₄?1.00，CaCl₂·2H₂O?0.2，MgSO₄·7H₂O?1.00，pH調(diào)至7.0-7.3。

????本發(fā)明所述的Pseudomonas?xanthomarina?DN1為反硝化細(xì)菌，可廣泛應(yīng)用于各種富營(yíng)養(yǎng)化水體的凈化。?????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1?反硝化細(xì)菌的篩選與鑒定

1、培養(yǎng)基配方

LB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨1，酵母提取物0.5，氯化鈉1，pH?7.0~7.2。需要時(shí)使用前加入100?μg?/ml?氨芐青霉素，固體培養(yǎng)基添加2%瓊脂，用于大腸桿菌的培養(yǎng)。