[發明專利]一種用膠原微載體在反應器中擴大培養動物細胞的方法

無效

• 申請號: 201310568972.6
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103614333A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 馮玉萍;喬自林;令世鑫;李明生;馮若飛;王家敏;馬忠仁
• 申請（專利權）人: 喬自林;馬忠仁;令世鑫;馮玉萍;馮若飛;李明生;王家敏
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12N5/071;C12N5/02
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 張秋云

技術領域

本發明涉及細胞培養領域，具體涉及用膠原微載體在反應器中擴大培養動物細胞的方法。

背景技術

目前，我國大多數疫苗仍采用傳統的轉瓶貼壁培養細胞的工藝生產，如獸用的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗（藍耳病疫苗）、豬圓環病毒疫苗、豬細小病毒疫疫苗、豬瘟病毒疫苗和羊痘疫苗等，人用的有乙腦疫苗、甲肝疫苗和水痘疫苗等。傳統工藝生產的疫苗存在批間差大、批量小，建設廠方面積大，生產過程人力物力投入大，總體來說生產成本高、產品質量不穩定。近幾年有些品種的疫苗采用了反應器培養的工藝，如豬瘟疫苗采用了反應器紙片載體培養細胞的工藝，狂犬病疫苗采用了反應器微載體培養工藝，但最大的培養體積只有35L。這些工藝由于解決不了細胞線擴大培養工藝難題而使規模不能線性放大，并且這些工藝中所用的培養載體（如紙片載體和微載體）都是進口的，生產成本高。

發明內容

本發明的目的就是針對上述現有技術中的缺陷，提供了一種操作簡單，成本低廉的用膠原微載體在反應器中擴大培養動物細胞的方法。

為了實現上述目的，本發明提供的技術方案為：一種用膠原微載體在反應器中擴大培養動物細胞的方法，包括以下步驟：

1）微載體處理：

將微載體以含有吐溫-80的純化水浸泡，再以PBS平衡鹽溶液清洗后，轉入至反應器或懸浮培養瓶中，高壓滅菌，冷卻靜置，以含新生小牛血清的細胞培養液清洗后加入相同體積的含新生小牛血清的細胞培養液備用；

2）胰蛋白酶消化微載體和細胞：

????消化1g長滿細胞的膠原微載體用質量百分比濃度為0.25%的胰蛋白酶25-50ml的比例使用胰蛋白酶；

3）細胞擴大培養：

????從方瓶→0.25-2L懸浮培養瓶→5-7.5L反應器→50-120L反應器→250L反應器→線性放大。

進一步的，上述的一種用膠原微載體在反應器中擴大培養動物細胞的方法，所述步驟1）中的微載體處理，是按照以下步驟進行的：

a）所述膠原微載體為GF-240型微載體，將GF-240型微載體用含體積百分含量為萬分之一的吐溫-80的純化水浸泡3-12h，期間攪拌一次使之充分浸泡，純化水的用量為每1g微載體浸泡需20-100ml含吐溫的純化水；

b）將步驟a）處理的微載體棄純化水，用無Ca²⁺、Mg²⁺的PBS平衡鹽溶液洗2次，每次清洗1g微載體需要20-100mlPBS平衡鹽溶液，所述PBS平衡鹽溶液的pH值為7.2±0.1,?滲透壓在290-320mmol/kg之間；

c）將步驟b）處理的微載體棄PBS平衡鹽沉溶液，用PBS平衡鹽溶液制成2-20g/L的濃度后轉移到反應器或懸浮培養瓶中，連同反應器或懸浮培養瓶以121℃高壓蒸汽滅菌30min，自然冷卻或向其中通空氣加速冷卻至室溫后靜置30min以上，所述PBS平衡鹽溶液的pH值為7.2±0.1,?滲透壓在290-320mmol/kg之間；

d）將步驟c）處理的微載體棄PBS平衡鹽溶液，用含體積百分含量10%新生小牛血清NBCS的細胞培養液洗1遍后再加相同體積的含體積百分含量2%-10%的新生小牛血清NBCS的細胞培養液備用；洗1g微載體需要20-50ml含體積百分含量10%新生小牛血清NBCS的細胞培養液。

所述的細胞培養液是指將市售的MEM、DMEM和DMEM/F12等成品干粉培養基，按說明書配成液體，使用時加入相應比例的NBCS后用于培養動物細胞。

進一步的，上述的一種用膠原微載體在反應器中擴大培養動物細胞的方法，所述細胞擴大培養的過程包括以下步驟：

A）細胞復蘇與擴增培養：按常規方法復蘇細胞，在含體積百分含量8%-10%新生小牛血清NBCS的細胞培養液培養至單層，按常規方法用質量百分比濃度為0.25%-1%胰蛋白酶消化傳代細胞至總量達下述B）所需的量；