[發明專利]孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法

無效

• 申請號: 201310568708.2
• 申請日: 2013-11-15
• 公開（公告）號: CN103602632A
• 公開（公告）日: 2014-02-26
• 發明（設計）人: 吳超群;徐曉麗
• 申請（專利權）人: 邯鄲市康業生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073;C12N5/078
• 代理公司: 石家莊國為知識產權事務所 13120
• 代理人: 陸林生

1.一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：包括以下步驟：（1）富集有核細胞

①采全血；

②離心，收集細胞沉淀物；

③制備細胞懸液：在細胞沉淀物中加入等體積的36～38℃的RPMI1640細胞培養液，RPMI1640細胞培養液中含有質量分數為10%的胎牛血清，充分混勻制得稀釋的細胞懸液；

④離心管中預置細胞分離液，加入稀釋的細胞懸液于分層液面上；

細胞分離液的組成為：質量分數為9％的聚蔗糖?20～30份、質量分數為33.9％的泛影葡胺5～15份；

⑤離心，得到細胞層；

⑥吸取細胞層，轉移到另一個離心管中，加入Hank^，s液，混勻、室溫離心、洗滌細胞；

⑦在步驟⑥的離心管中加入等體積的平衡鹽緩沖液，混勻，離心，用平衡鹽緩沖液重懸細胞；

（2）母血中胎兒有核細胞篩選

⑧取步驟⑦重懸后得到的細胞懸液，加入鼠抗人的單克隆抗體試劑，充分混勻，在4℃冰箱中避光反應30分鐘；

⑨離心，棄上清液，用平衡鹽緩沖液洗滌，離心，棄上清液，收集細胞，分選出胎兒有核紅細胞；

⑩分選得到的胎兒有核紅細胞圖片，進行四重形態學標準鑒定，收集符合標準的胎兒有核紅細胞。

2.如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟②中800g水平離心10分鐘。

3.如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟④中每3mL細胞分離液中加入4mL稀釋的細胞懸液。

4.、如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟⑤中水平轉子700～800g，離心20～30min。

5.如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟⑥中Hank^，s液的加入量為核細胞層體積的5倍以上，室溫400g離心10分鐘。

6.如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟⑦中平衡鹽緩沖液為PBS緩沖液，400g離心10分鐘。

7.如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟⑧在細胞懸液中加入細胞懸液體積1/10的帶熒光標記的鼠抗人的單克隆抗體CD45試劑。

8.如權利要求1所述的一種孕婦外周血中胎兒有核紅細胞的分離方法，其特征在于：步驟⑨第一次400g離心5分鐘，用平衡鹽緩沖液洗滌后，再400g離心5分鐘。