[發(fā)明專利]一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法

有效

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• 申請日: 2012-05-10
• 公開（公告）號: CN103756979A
• 公開（公告）日: 2014-04-30
• 發(fā)明（設計）人: 陳堅;堵國成;陸信曜;劉松;張娟
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N9/26;C12N9/10;C12N15/70
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛;王玉松

技術領域

本發(fā)明涉及一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，特別是一種利用雙親短肽融合表達提高重組酶的熱穩(wěn)定性的方法。

背景技術

雙親短肽是具有親水和親油能力的小分子肽，廣泛存在于膜蛋白及脂肪代謝相關酶類的結構中。其雙親的特點能夠幫助酶分子與疏水性底物結合、實現(xiàn)酶分子的定位等。

生物活性酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的應用，而提高酶的熱穩(wěn)定性是工業(yè)酶的研究重點之一。目前，提高酶熱穩(wěn)定性的方法主要包括：1.定向進化：通過定點突變，隨即突變，飽和突變等技術，篩選得到熱穩(wěn)定的突變株；2.從嗜熱微生物中篩選熱穩(wěn)定性的酶。但是，這些方法并不適用于所有酶分子熱穩(wěn)定性改造中。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，通過在重組酶的N端或C端融合表達雙親短肽實現(xiàn)酶熱穩(wěn)定性的提高。

為解決上述技術問題提供如下技術方案：

第一步雙親短肽基因的獲得

根據(jù)雙親短肽的氨基酸序列，化學合成相應的DNA序列，并將其克隆至大腸桿菌表達質粒pET-22b(+)的Nde?I和Nco?I酶切位點之間上，構建成為pET-22b(+)/AP質粒；

第二步融合雙親短肽的重組酶表達質粒的構建

將重組酶基因克隆至pET-22b(+)/AP質粒的Nco?I和Hind?III位點之間。構建成為表達融合雙親短肽的重組酶表達質粒pET-22b(+)/AP-enzyme。

第三步融合雙親短肽的重組酶表達菌株的構建

將重組質粒pET-22b(+)/AP-enzyme轉化宿主大腸桿菌(E.coli?BL21(DE3))，構建高效表達目的酶的誘導型大腸桿菌基因工程菌。

菌株經(jīng)培養(yǎng)表達目的酶的方法為：

培養(yǎng)基組成(g/L)：

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化鈉5；

發(fā)酵培養(yǎng)基：將下列組分溶解在0.9L水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4mL。；

各組分溶解后高壓滅菌；冷卻到60℃，再加100mL滅菌的170mmol/L?KH₂PO₄/0.72mol/L?K₂HPO₄的溶液(2.31g的KH₂PO₄和12.54gK₂HPO₄溶在足量的水中，使終體積為100mL；高壓滅菌或用0.22μm的濾膜過濾除菌)；

培養(yǎng)方法：種子培養(yǎng)，挑取工程菌單菌落接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉速200r/min，培養(yǎng)12h；發(fā)酵培養(yǎng)，按10%的接種量接入裝液量為25mL的三角瓶(250mL)中，培養(yǎng)溫度37℃，當OD₆₀₀達到0.6時，將培養(yǎng)溫度降為16℃，同時加入終濃度為1.0mM的誘導劑IPTG。

目的酶熱穩(wěn)定的測定方法：

將目的酶分別應用疏水層析、離子交換層析等分離手段，得到電泳純的目的酶。將目的酶在一定溫度下保溫，測定酶活相比初始未保溫時損失50%所需要的時間(T1/2)。

本發(fā)明提供了一種提高酶熱穩(wěn)定性的方法，應用雙親短肽融合表達重組酶能夠提高目的重組酶的熱穩(wěn)定性。該方法具有效果顯著、工藝簡單、便于推廣。本發(fā)明為快速提高工業(yè)酶熱穩(wěn)定性提高了新的方法和思路。

具體實施方式

以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明，下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。

材料和方法：所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR試劑，DNA?Marker等均購于TaKaRa寶生物公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞E.coli?JM109，引物，質粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒均購于上海生工生物工程公司。

實施例1：雙親短肽的氨基酸序列并克隆至質粒pET-22b(+)

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