[發(fā)明專利]一株防治獼猴桃潰瘍病的菌株及其制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310567706.1
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN103667114A
• 公開（公告）日: 2014-03-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃麗麗;高小寧;康振生;涂璇
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;C12R1/465
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新的植物內(nèi)生青色鏈霉菌及菌劑的制備方法和應用。

背景技術(shù)

由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種Pseudomonas?syringae?pv.actinidiae（即PSA）引起的獼猴桃細菌性潰瘍病（Kiwifruit?bacterial?canker）危害嚴重，防治困難，不但嚴重阻礙了獼猴桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且明顯制約了我國獼猴桃花粉、水果的外貿(mào)出口，已成為目前獼猴桃生產(chǎn)中需要盡快解決的重大問題。目前對于獼猴桃細菌性潰瘍病的防治主要是采用以鏈霉素和銅制劑為主的藥劑防治。然而大量使用銅制劑和已經(jīng)引起了潰瘍病菌的抗藥性問題，同時抗生素的大量使用所帶來的食品安全問題已經(jīng)嚴重影響著潰瘍病的田間防治效果。因而尋找開發(fā)新型高效的生物農(nóng)藥將對獼猴桃產(chǎn)業(yè)的穩(wěn)定和發(fā)展帶來福音。

放線菌是一類重要的微生物資源，也是與人類有著密切關(guān)系且應用極為廣泛的一類微生物。目前應用在臨床和農(nóng)業(yè)上的抗生素主要是由放線菌產(chǎn)生，其中70%的抗生素來自鏈霉菌。近年來研究海洋放線菌、極端環(huán)境放線菌和稀有放線菌是尋找新藥的集中目標，開發(fā)植物內(nèi)生環(huán)境的放線菌資源也是人們研究的新領(lǐng)域。植物內(nèi)生放線菌尤其是藥用植物內(nèi)生放線菌作為尋找新的藥用活性代謝產(chǎn)物和防治植物病害的生防制劑資源極具開發(fā)潛力。利用這些植物內(nèi)生菌資源，使之為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務將具有重要的理論意義和實際應用價值。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的旨在探尋生物農(nóng)藥的新來源，利用藥用植物內(nèi)生放線菌資源開發(fā)一種可以用于獼猴桃細菌性潰瘍病防治的新型生物殺菌劑。本發(fā)明提供了一種楊凌青色鏈霉菌（Streptomyces?glaucus?sp.nov.yangling）菌株以及該菌株分離、篩選、鑒定方法；進一步地，提供該菌株抗菌活性物質(zhì)及其制備工藝，并且提供了該菌株菌劑防治獼猴桃細菌性潰瘍病的使用方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

楊凌青色鏈霉菌（Streptomyces?glaucus?sp.nov.yangling）TIASA5菌株（以下簡稱為TIASA5菌株），已于2007年8月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC?No.2132。保藏期限為30年，30年內(nèi)免費提供活菌。

需要說明的是，本發(fā)明TIASA5菌株的分離、篩選、鑒定方法包括如下步驟：

（1）剪取采自陜西楊凌渭河河灘的健康野生黃花蒿的莖組織用清水洗凈后，進行表面消毒；

（2）將表面消毒后的樣品材料用滅菌刀片切成0.2mm長的小段，置于高氏一號培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)21天后，可分離到TIASA5菌株，于-80℃冰箱保存。

需要進一步說明的是，所述的表面消毒的條件：樣品先用99%乙醇中浸1min，然后在3.125%的NaClO中浸6min，再次放入99%乙醇中浸30sec，最后用無菌生理鹽水沖洗5次。

所述的高氏一號培養(yǎng)基每升含可溶性淀粉20g，KNO₃?1g，K₂HPO₄?0.5g，MgSO₄?5H₂O?0.5g，NaCl?0.5g，F(xiàn)eSO₄?7H₂O?0.01g，瓊脂粉13g，pH7.2-7.4。

本發(fā)明的TIASA5菌株經(jīng)菌落培養(yǎng)特征、菌絲形態(tài)的顯微觀察、細胞化學分析、生理生化特性以及16s?rDNA序列分析，該菌株鑒定為一個新菌株（TIASA5）具有以下特征：

（1）菌落培養(yǎng)特征在高氏一號平板上菌落較小，菌落為圓形，凸起，孢子堆顏色為橄欖灰色，氣生菌絲發(fā)達，基內(nèi)菌絲前期為白色，3-5d后呈絳紅色，在各培養(yǎng)基上都不產(chǎn)生可溶性色素；

（2）菌絲和孢子形態(tài)特征：菌株的氣生菌絲呈松散的螺旋狀，且表面有細長的毛發(fā)狀突起，孢子呈橢圓形，表面亦有毛發(fā)狀突起；