[發明專利]一種植酸酶及其應用

有效

• 申請號: 201310567641.0
• 申請日: 2013-11-14
• 公開（公告）號: CN103589700A
• 公開（公告）日: 2014-02-19
• 發明（設計）人: 王華明;徐娟;黃亦鈞
• 申請（專利權）人: 青島蔚藍生物集團有限公司;濰坊康地恩生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/80;C12N1/15;A23K1/165;C12R1/685;C12R1/645
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 曾慶國

技術領域

本發明屬于功能基因篩選技術領域，具體涉及一種植酸酶及其應用。?

背景技術

植酸酶（Phytase）即肌醇六磷酸水解酶（EC3.1.3.8），是催化植酸以及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽）的一類酶的總稱。?

植酸酶作為一種優良的飼料添加劑目前被廣泛地應用于畜牧業生產中，它能夠提高動物對磷元素的利用率，以及蛋白質、氨基酸、各種礦物元素的利用率，解除動物植物性飼料中植酸的抗營養作用，提高植物性飼料的營養價值，同時降低動物排泄物對環境的污染，在動物生產以及在環境保護中，是極為有效的一種添加劑，具有重要的應用價值。另外，農業部、環保部聯合印發的《全國畜禽養殖污染防治“十二五”規劃》中指出，將重點治理畜禽養殖污染，這也給植酸酶應用提供了更有利的機遇。?

目前研究的植酸酶主要來源于Saccharomyces?cerevisiae(Bajwa?et?al.,1984;Meyhack?et?al.,1982)、Aspergillus?niger(MacRae,1998)、A.terreus和Myceliophthora?thermophila(Van?Loon,1995)、A.niger(ficuum)(Van?Hartimgsveldt?et?al.,1993;Ehlich?et?al.,1993;Bin?Y?et?al.,1998)等。不同來源的植酸酶具有不同的酶學性質，但目前的植酸酶普遍存在耐熱性不高，表達量低的問題，制約了植酸酶在飼料領域更為廣泛的應用。?

發明內容

本發明的目的是提供一種新型植酸酶及其應用，本發明從黑葡萄穗霉（Stachybotrys?chartarum）中得到一個編碼植酸酶的基因，并將該基因進行克隆，在黑曲霉（Aspergillus?niger）中表達，篩選得到高效表達植酸酶的基因工程菌株，從而為高密度發酵和工業化生產奠定基礎。?

本發明一方面提供了一種來源于黑葡萄穗霉的植酸酶，其特征在于：?

1）其氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的植酸酶；?

2）在1）中的氨基酸上發生取代、缺失或添加一個或數個氨基酸得到的，具有1）中植酸酶活性的酶。?

本發明另一方面提供了編碼上述植酸酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ?ID?NO:2。?

本發明還提供了一種表達載體，其包含上述編碼植酸酶基因的核苷酸序列。?

本發明另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述植酸酶基因?的表達載體。?

上述表達宿主細胞為黑曲霉（Aspergillus?niger）。?

本發明的植酸酶用于制備飼料添加劑。?

本發明構建的黑曲霉工程菌能高效表達植酸酶，搖瓶發酵結果顯示其酶活為434U/mL。本發明的植酸酶作為飼料添加劑，能顯著提高肉雞的日采食、日增重，降低料肉比，增加養殖戶的經濟效益。此外，在日糧中添加本發明的重組植酸酶可使肉雞的磷排泄量比對照組降低13.8%，說明本發明的植酸酶能有效提高肉雞對飼料中磷的吸收率，減少含磷廢物的排泄，有利于保護生態環境。?

附圖說明

圖1：本發明構建的pGm-Scphy重組表達載體質粒圖譜。?

圖2：黑曲霉WLScphy發酵上清液SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指59kD處為重組表達的植酸酶。?

圖3：重組表達的植酸酶相對酶活-溫度曲線圖。?

圖4：重組表達的植酸酶相對酶活-pH曲線圖。?

具體實施方式

下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克（Sambrook）等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求范圍不僅限于所提供的具體案例，而應包括本領域技術人員在本說明書基礎上，不需經過創造性勞動就能擴展的保護范圍。?

實施例1：植酸酶基因的克隆?

使用真菌基因組DNA提取試劑盒(Omega)從黑葡萄穗霉過夜培養物中提取基因組DNA。?

以黑葡萄穗霉基因組DNA為擴增模板擴增黑葡萄穗霉中的植酸酶基因，其中所用到的正向引物P-F序列為(下劃線所示序列為AflII酶切位點)；?