[發明專利]巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基共表達載體

無效

• 申請號: 201310566278.0
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103571866A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 周培;馮海瑋;支月娥;孫玉靜;陸偉;劉群錄;衛星;時唯偉;初少華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N1/21;B09C1/10;C12R1/11
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王毓理;王錫麟

技術領域

本發明涉及的是一種基因工程技術領域的方法，具體是一種硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基基因序列、含有該基因的重組載體、重組菌以及利用該重組菌產生該基因的表達產物及其應用。?

背景技術

隨著設施農業的發展，栽培面積不斷擴大，氮素化肥使用量大幅度上升，大大超過植物的需求量。由于土壤中硝酸鹽未能被植物及時吸收轉化，造成大量鹽分在植物體和土壤中積累，從而造成設施栽培土壤次生鹽漬化。?

研究表明，設施栽培次生鹽漬化土壤中除HCO₃^-外，Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、SO₄^2-、NO₃^-均有不同程度的積累。研究表明，次生鹽漬化土壤的陽離子組成中，Na⁺已不是主要離子，陽離子以Ca²⁺為主，其含量約占陽離子總量的60%以上，Mg²⁺含量在15%-20%之間；陰離子以NO₃^-和SO₄^2-為主，NO₃^-含量約為陰離子總量的56%-76%。NO₃^-可在植物體內累積，最終通過食物鏈進入人體，過量的NO₃^-在體內易被還原成為NO₂^-，NO₂^-可使細胞組織缺氧，嚴重時使人窒息死亡。因此治理設施栽培中過量的硝態氮已成為設施農業一項重要且刻不容緩的工作。目前針對我國設施栽培大棚鹽漬化，采取了一些治理措施，如灌水洗鹽，土壤改良劑法和半腐熟有機肥法等方法。雖然這些方法有不少優點，但也存在很大的不足：灌水洗鹽會把硝態氮淋洗到地下，不僅造成土壤氮素的損失，而且還污染地下水；土壤改良劑法成本比較高，易產生二次污染；半腐熟有機肥法存在肥效慢，使用不便等缺點。?

與傳統治理次生鹽漬化方法相比，生物法尤其是生物酶法有許多突出優點，比如見效快、不會給周邊環境帶來負擔。但是一般而言硝酸鹽還原酶在微生物體內的表達量很低，不能滿足修復環境的要求，于是構建一種高效的硝酸鹽還原酶表達載體，實現硝酸鹽還原酶的高效表達就顯得尤為關鍵。?

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提出一種巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移亞基共表達載體，克服現有技術中由于硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列在天然的巨大芽孢桿菌中表達量非常低，嚴重限制使用效果，應用基因工程菌表達本發明所述的硝酸鹽還原酶電子轉移亞基基因序列，實現極大的提高該基因的表達量。?

本發明是通過以下技術方案實現的：?

本發明涉及一種巨大芽孢桿菌硝酸鹽還原酶催化-電子轉移共表達載體，由硝酸鹽還原酶催化亞基Bm-Nas?B，其核苷酸序列如Seq?ID?No.1所示，以及硝酸鹽還原酶電子轉移亞基Bm-Nas?C，其核苷酸序列如Seq?ID?No.2所示組成。?

所述的催化亞基和電子轉移亞基的基因序列分別由2346和2151個堿基對組成。?

所述的共表達載體為包含硝酸鹽還原酶催化亞基序列Bm-Nas?B以及硝酸鹽還原酶電子轉移亞基序列Bm-Nas?C的pETDuet-1質粒。?

本發明涉及上述共表達載體的構建方法，首先測定巨大芽孢桿菌全基因組序列作為模板，根據設計出的PCR引物擴增出含有酶切位點硝酸鹽還原酶催化亞基(Bm-Nas?B)和電子轉移亞基(Bm-Nas?C)的基因序列，并依次連接到共表達載體pETDuet-1上，通過菌落PCR技術挑選含有目的基因片段的大腸桿菌DH5α的陽性克隆。?

所述的大腸桿菌DH5α的陽性克隆是指：含有重組表達質粒pETDuet-1-Bm-Nas?B-Nas?C的大腸桿菌BL21(DE3)。?

本發明涉及上述大腸桿菌DH5α的陽性克隆的應用，將其發酵后修復次生鹽漬化土壤。?

所述的應用進一步是指：將該共表達載體倒入大腸桿菌BL21(DE3)內，通過加入IPTG進行誘導，使該重組菌表達出具有生物學活性的硝酸鹽還原酶，進而優化發酵條件提高硝酸鹽還原酶的表達量，最終實現酶制劑法修復次生鹽漬化土壤。?