[發明專利]高表達gga-miR-9*的雞胚成纖維傳代細胞株

有效

• 申請號: 201310565243.5
• 申請日: 2013-11-13
• 公開（公告）號: CN103773735A
• 公開（公告）日: 2014-05-07
• 發明（設計）人: 歐陽偉;王永山;潘群興;王曉麗;夏興霞;劉華潔;張海彬
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

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一、技術領域

本發明涉及一種能高表達gga-miR-9*的雞胚成纖維傳代細胞株，屬于生物技術領域。

二、背景技術

????傳染性法氏囊病（Infectious?bursal?disease,?IBD）是由傳染性法氏囊病病毒（IBDV）引起的一種侵害雛雞淋巴組織，特別是中樞免疫器官—法氏囊為主要特征的傳染病。該病不但引起患病動物死亡，而且還導致機體免疫抑制，使機體的免疫防御能力降低和疫苗免疫接種失敗。由于IBDV的生物學性質穩定、易變異以及多種禽鳥類可攜帶傳播，致該病毒難以根除，目前，仍是危害養雞業的主要傳染病之一。

IBDV屬雙RNA病毒科，基因組包括大（A）小（B）兩個節段，編碼五種病毒蛋白：VP1、VP2、VP3、VP4和VP5。VP1是病毒的非結構蛋白，是由B節段編碼的一種依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent?RNA?polymerase,?RdRp），VP1與病毒RNA的復制和毒力有關。A節段含有兩個部分重疊的開放閱讀框（ORF），其中一個大ORF編碼多聚蛋白，然后被加工成VP2、VP4和VP3。VP2和VP3是病毒的結構蛋白，構成病毒衣殼，VP2占結構蛋白總量的51%，既是病毒的主要結構蛋白，又是病毒的主要保護性抗原。VP3和病毒RNA組成螺旋狀的核蛋白復合物，位于病毒顆粒內部。VP4為病毒自身蛋白酶。另一個小ORF編碼VP5，是病毒的非結構蛋白，與病毒的毒力和復制效率有關。?

接種疫苗是預防IBD的有效方法，可降低發病率，減少經濟損失。目前，IBD滅活疫苗或弱毒活苗的生產主要采用雞胚或原代雞胚成纖維細胞培養IBDV的方法，該方法的生產成本高，批間差異較大，更大的問題是在疫苗生產過程中存在著蛋源性和外源性疫病傳播的巨大風險。用雞胚成纖維傳代細胞系DF-1培養IBDV，病毒滴度較低，生產成本高。因此，亟需構建培育一種能夠安全高效培養IBDV的細胞株。?

microRNA?(miRNA)是由19-25個核苷酸（3′端可有1~2個堿基長度的變化）組成的內源非編碼小RNA，是一類基因表達調控因子，在轉錄后和翻譯水平調控著基因的表達。miRNA本身不具有開放閱讀框（ORF），但可以作為一種引導性分子通過堿基配對與靶mRNA結合，從而在轉錄后水平引起靶mRNA的剪切或是翻譯的抑制，在不同的調節途徑中發揮關鍵作用，包括發育時序的控制、細胞分化、細胞增殖、細胞凋亡、代謝、激素分泌、腫瘤發生、免疫應答等多種生理和病理過程?。?

為了分析細胞miRNA對IBDV復制的影響，我們用IBDV?強毒感染SPF雞，用miRNA芯片技術分析IBDV感染之后的細胞內源性miRNA表達量的變化，結果顯示IBDV感染對細胞內源性miRNA的表達影響顯著，表達上調的microRNA有30個，表達下調的microRNA有18個。對這些miRNA進行過表達和抑制表達試驗分析，發現gga-miR-9*可顯著促進IBDV在DF-1細胞中的復制。?

本發明的目的是基于細胞內源性gga-miR-9*可促進IBDV復制的分子調控功能，運用慢病毒表達系統構建一株能高表達細胞內源性gga-miR-9*的雞胚成纖維傳代細胞株，該細胞株培養IBDV，能夠顯著提高細胞培養物中IBDV的滴度，可高效地用于IBDV抗原制備和疫苗生產。?

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三、發明內容

技術問題??

傳染性法氏囊病(IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的雞和火雞的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，是引起我國及世界養禽業經濟損失嚴重的主要傳染病之一。

接種疫苗是預防IBD的有效方法，可降低發病率，減少經濟損失。目前，IBD滅活疫苗或弱毒活苗的生產主要采用雞胚或原代雞胚成纖維細胞培養IBDV的方法，該方法的生產成本高，批間差異較大，更大的問題是在疫苗生產過程中存在著蛋源性和外源性疫病傳播的巨大風險。用雞胚成纖維傳代細胞系DF-1培養IBDV，病毒滴度較低，生產成本高。因此，亟需構建培育一種能夠安全高效培養IBDV的細胞株。?

????本發明的目的是基于細胞內源性gga-miR-9*可促進IBDV復制的分子調控功能，運用慢病毒表達系統構建一株能高表達細胞內源性gga-miR-9*的雞胚成纖維傳代細胞株，用細胞株培養IBDV，能夠顯著提高細胞培養物中IBDV的滴度，可高效地用于IBDV抗原制備和疫苗生產。?

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技術方案