[發明專利]地衣芽胞桿菌表達宿主

有效

• 申請號: 201310562150.7
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN104630123B
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 陳守文;周銀華;魏雪團;陳敬幫;祁高富;冀志霞
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N9/26;C12N9/20;C12N9/50;C12N15/75;C12R1/10
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

本發明公開了一種多基因缺失的地衣芽胞桿菌宿主菌BL10，保藏編號為CCTCCNO：M2013400。該宿主菌來源于地衣芽胞桿菌WX?02，部分或完全缺失了10個基因。這10個基因分別是8個蛋白酶基因(mpr，編碼胞外金屬蛋白酶；vpr，編碼絲氨酸蛋白酶；aprX，胞內絲氨酸蛋白酶；epr，編碼微小胞外蛋白酶；bpr，編碼芽胞桿菌肽酶F；wprA，編碼與細胞壁結合的蛋白酶；aprE，編碼胞外堿性絲氨酸蛋白酶；bprA，編碼芽胞桿菌肽酶F)和2個胞外分泌蛋白基因(hag，編碼鞭毛蛋白；amyL，編碼α?淀粉酶)。BL10完全無胞外蛋白酶活性，可降低蛋白酶對目標蛋白的降解作用。當利用該表達宿主表達目標蛋白時，表達量更高，該宿主菌有利于增強蛋白的表達。

技術領域

本發明屬于微生物基因工程技術領域，具體涉及重組的地衣芽胞桿菌BL10宿主菌株，以及在此宿主細胞中表達目的蛋白的方法。

背景技術

在研究蛋白表達的過程中，發展了多種有價值的表達系統，主要包括原核表達系統和真核表達系統。原核表達系統是最早被采用，也是目前研究得相對成熟的表達系統。目前最常用的原核表達系統有大腸桿菌表達系統、枯草芽胞桿菌表達系統和鏈霉菌表達系統等，其中大腸桿菌表達系統應用最為廣泛，枯草芽胞桿菌用于分泌表達目標蛋白也越來越受到重視。目標蛋白在胞內完成轉錄翻譯后，從胞內出來在周質空間正確折疊并通過細胞壁來到胞外，就需要選擇合適的信號肽酶高效的切除信號肽，并抑制細胞壁和胞外存在的大量蛋白酶的活性，減少蛋白酶對目的蛋白的降解。提高目標蛋白分泌表達最重要的一步就是抑制其折疊環境的蛋白酶活性。通過缺失8個蛋白酶基因(nprE；nprB；aprE；epr；mpr；bpf，vpr；wprA)，前人構建了枯草芽胞桿菌WB800宿主菌，可高效表達多種目標蛋白，顯示了巨大的應用潛力(Murashima等，J Bacteriol，2002，184：76-81；Westers等，J Biotechnol，2006，123：211-224)。缺失WB800菌株的的蛋白酶基因AprX(編碼穩定期后期隨細胞裂解釋放到胞外的蛋白酶)和HtrA／HtrB(編碼與細胞膜結合的蛋白酶)，得到重組菌Dpr9ΔhtrA／B，其表達α-amylase-A522-PreS2產量達到80mg／L，LipA的產量可達到1100mg／L，進一步提高了目標蛋白產量(Kodama等，Adv Appl Biotechnol，2012，8：163-176)。

地衣芽胞桿菌作為一個新型表達系統，目前對其研究主要在于利用野生型表達其自身的蛋白，對于該新型表達宿主的改造還處于初步的探索階段，與枯草芽胞桿菌相比，地衣芽胞桿菌生長溫度高5-7度；其生長速率適中，容易使剛跨膜的未合適折疊的蛋白充分折疊，分泌蛋白至培養基的能力大約是枯草芽胞桿菌的2倍，在特定優化的發酵工藝條件下，特定蛋白表達水平可達到30mg／ml，為所見報道的所有芽胞桿菌表達水平最高者。還未見構建同時缺失mpr(編碼胞外金屬蛋白酶)、vpr(編碼絲氨酸蛋白酶)、aprX(胞內絲氨酸蛋白酶)、epr(編碼微小胞外蛋白酶)、bpr(編碼芽胞桿菌肽酶F)、wprA(編碼與細胞壁結合的蛋白酶)、aprE(編碼胞外堿性絲氨酸蛋白酶)、bprA(編碼芽胞桿菌肽酶F)、hag(編碼鞭毛蛋白)和amyL(編碼α-淀粉酶)的地衣芽胞桿菌宿主菌。構建高效分泌表達目標蛋白的地衣芽胞桿菌宿主菌，具有重要的應用價值。本研究構建的目標蛋白表達系統，是一種性能優異的原核表達系統。

發明內容

本發明目的在于克服現有技術的缺陷，通過構建無痕敲除載體，敲除能抑制目標蛋白表達的10個有關的基因，最終獲得完全沒有胞外蛋白酶活性的地衣芽胞桿菌宿主菌株。

本發明的另一目的是提供一種利用BL10高效表達目標蛋白的方法。

本發明的目的是這樣實現的：