[發(fā)明專利]水仙BES-SSR標(biāo)記引物AG9及鑒定水仙品種的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310562140.3
• 申請(qǐng)日: 2013-11-13
• 公開（公告）號(hào): CN103555854A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祁世明;潘東明;郭志雄;潘騰飛;林琳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

1.一種水仙BES-SSR標(biāo)記引物AG9，由上游引物AG9F和下游引物AG9R組成，其特征在于核苷酸序列如下：

AG9?F:?5'-GAGCTTCCCTCCGAGGTTA-3'

AG9?R:?5'-TCCACAAATTCTTCACAAAGAT-3'。

2.利用如權(quán)利要求1所述的水仙BES-SSR標(biāo)記引物AG9鑒定水仙品種的方法，包括水仙基因組總DNA提取、PCR總反應(yīng)體系建立、PCR擴(kuò)增程序、聚丙烯酰胺凝膠電泳條件和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定，其特征在于：

（1）水仙基因組總DNA提取：利用改良的CTAB法提取水仙基因組總DNA；

（2）PCR總反應(yīng)體系建立：總反應(yīng)體系20ul：供鑒定的水仙基因組總DNA?50ng，10×PCR?Buffer?2ul，10mmol/L?dNTPs?0.5ul，10mmol/L水仙AG9上下游引物各1.0ul，5U/L?Taq?DNA聚合酶?0.2ul，無(wú)菌ddH₂O?12.8ul；所述供鑒定的水仙，本發(fā)明共提供24份水仙品種樣品；

（3）PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min，94℃變性30s，52℃退火30s，72℃?延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存；

（4）聚丙烯酰胺凝膠電泳條件：1×TBE電泳緩沖液，體積比為8%的聚丙烯酰胺凝膠，在電壓400V，電流100mA下電泳3.0h后用銀染法染色，經(jīng)ImageScanner?Ⅲ凝膠掃描儀掃描保存；

（5）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)鑒定：利用水仙BES-SSR標(biāo)記引物AG9，對(duì)24份水仙的樣品進(jìn)行品種鑒定，于聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)的PCR擴(kuò)增圖譜中，在分子量為218bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為中國(guó)多花水仙金盞銀臺(tái)；在分子量為161bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為中國(guó)多花水仙重瓣玉玲瓏；在分子量為192bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Replete；在分子量為362bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋小冠水仙Alltruist；在分子量為163bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Jetfire；在分子量為288bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Tahiti；在分子量為219bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋裂冠水仙Orangerie；在分子量為165bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Yellow?Cheerfulness；在分子量為190bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋紅口水仙Recurvus；在分子量為151bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙Erlicheer；在分子量為191bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋三蕊水仙Thalia；在分子量為141bp?的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Mount?Hood；在分子量為309bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋多花水仙White?Favourite；在分子量為162bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋長(zhǎng)壽花水仙Silver?Smiles；在分子量為256bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Pink?Charm；在分子量為186bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Johann?Strauss；在分子量為215bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋小冠水仙Barret?Browning；在分子量為140bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋喇叭水仙Dutch?Master；在分子量為305bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Fortissimo；在分子量為146bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Daydream；在分子量為244bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋重瓣水仙Gay?Tabor；在分子量為148bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋仙客來(lái)水仙Tete-a-Tete；在分子量為140bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Bella?Vista；在分子量為142bp的位置出現(xiàn)DNA條帶，則該品種為西洋大冠水仙Carlton。