[發(fā)明專利]一種抗人糖化白蛋白單克隆抗體及其用途

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310561370.8
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN103554256A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 賴增祖;葉欣;徐健;楊奎東
• 申請（專利權）人: 寧波艾科生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N15/13;G01N33/68;G01N33/577
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 張鉑

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種抗人糖化白蛋白單克隆抗體、單克隆抗體可變區(qū)基因及其用途。

背景技術

糖尿病作為一種慢性疾病，世界衛(wèi)生組織2011年九月的報告指出全世界有3.46億人患有糖尿病，而死于高血糖引起的后果人數(shù)在2004年估計就有340萬。最新流行病學調查顯示我國目前全國有糖尿病患者9240多萬人。全國糖尿病患病率9.7%，我國已經成為全球糖尿病患病率增長最快的國家之一，到2020印度成為世界上糖尿病人數(shù)最多的國家。糖尿病作為一種慢性疾病，血液血糖過高，可以引起許多并發(fā)癥。血糖監(jiān)測是糖尿病日常診治工作中非常重要的一個環(huán)節(jié)，血糖的有效檢測可以有效的血糖控制從而延緩糖尿病急、慢性并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展。血糖的有效檢測對控制血糖的濃度有著重要意義。糖化血清白蛋白（glycated?albumin,GA）是血液中的葡萄糖與白蛋白分子發(fā)生非酶促糖化反應的產物，其約占血漿中糖化蛋白總量的80%，GA蛋白的量和血糖水平有正相關。因白蛋白在體內比較穩(wěn)定，其半衰期短，約17-19天，故糖化血清白蛋白測定可有效反映體內過去2～3周內平均血糖水平。對于評價糖尿病患者近期血糖控制情況及反映短期內血糖水平的變化具有較高的臨床價值。目前GA蛋白的測定方法主要有（1）高壓液相離子交換法（HPLC法）。HPLC法測定GA可準確檢測患者短期內血糖控制的總體水平，但由于其代價高昂，處理樣本量小，不適宜臨床常規(guī)開展而未得到廣泛應用。（2）親和色譜法和（3）比色法以及（4）免疫化學法由于存在精確性差，檢測時間長等缺點，也沒有能夠推廣。（5）近年由日本開發(fā)研制的應用液態(tài)試劑的酶法檢測GA（GA-L），是在固體酶法（2002年由美國研制的一種特異性較高的糖化血清白蛋白測定方法）測定糖化血清蛋白的基礎上開發(fā)出液態(tài)試劑。其減少了溶解處理，提高了操作性。同時加用糖化氨基酸以去除內源性糖化氨基酸對檢測結果的影響，并利用對氧化性白蛋白特異性更高的溴甲酚紫替代原來的溴甲酚綠，減少了球蛋白對測定結果的影響，因此結果的精確性有一定提高。GA-L檢測具有相對良好的稀釋線性、日內重復性和日間穩(wěn)定性，并與HPLC檢測法有一定的一致性（r=0.879）。（6）免疫濁度法，可以快速準確特異測定血漿中糖化白蛋白的量。人糖化白蛋白和抗人糖化白蛋白抗體結合而出現(xiàn)凝集。從而阻礙光線透過，使透射光減少，其減少程度與人糖化白蛋白量成正相關。免疫濁度的的特異性、靈敏度及準確性取決于高度特異性和高親和力的抗人糖化白蛋白單克隆抗體。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種高度特異性的抗人糖化白蛋白單克隆抗體及其在糖化白蛋白檢測中的應用。本發(fā)明所提供的抗人糖化白蛋白單克隆抗體是利用單克隆抗體雜交瘤技術獲得。將人糖化白蛋白免疫注射小鼠，取免疫小鼠脾臟制備單細胞懸液，將其與小鼠骨髓瘤細胞進行細胞融合獲得。該抗體敏度高、穩(wěn)定性好，可大量制備，以及廣泛用于檢測人糖化白蛋白各種檢測試劑盒。

本發(fā)明技術方案具體如下：

一種抗人糖化白蛋白單克隆抗體，包括重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:2所示,所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:4所示。

上述的抗人糖化白蛋白單克隆抗體為IgG1亞型。

本發(fā)明還提供了編碼權利要求1所述的抗人糖化白蛋白單克隆抗體的基因，其特征在于編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，編碼輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。

本發(fā)明還提供了上述的抗人糖化白蛋白單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

（1）將完全福氏佐劑與人糖化白蛋白溶液制成乳劑免疫Balb/c小鼠，分離脾臟細胞，將分離的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞SP2/0細胞以50%PEG介導融合，用酶聯(lián)免疫法篩選陽性克隆，選取陽性最強的雜交瘤細胞；

（2）將陽性雜交瘤細胞腹腔注射乳成年Balb/e小鼠制備抗人糖化白蛋白單克隆抗體，2-4周后，吸取小鼠腹水，離心后吸取上請，用硫酸胺沉淀后，選擇蛋白A或蛋白G親和層析柱進行純化，得到純化的抗人糖化白蛋白單克隆抗體。所得的抗人糖化白蛋白單克隆抗體的親和力很高。抗體的效價大約為1x10⁵，抗體的親和力大約為1x10^-8M。