[發(fā)明專(zhuān)利]一種在植株水平上刪除轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)記基因的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310560710.5
• 申請(qǐng)日: 2013-11-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103589750A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王鋒;陳松彪;陳在杰;程倩倩;陳子強(qiáng);胡昌泉;林艷;田大剛;顏靜宛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/82
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種在植株水平上高效率刪除轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)記基因的方法。

背景技術(shù)

植物基因工程的發(fā)展，讓人們能夠?qū)⑼庠椿蜣D(zhuǎn)入到受體植物體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)定向改良植物相關(guān)性狀的目標(biāo)。在現(xiàn)有植物遺傳轉(zhuǎn)化階段，應(yīng)用選擇標(biāo)記基因是一種常規(guī)基礎(chǔ)手段。這些標(biāo)記基因主要有抗生素抗性基因或除草劑抗性基因等，其能夠使轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)抗生素抗性或除草劑抗性的產(chǎn)物，從而在選擇壓下繼續(xù)成活，最終分化成轉(zhuǎn)化植株（Dale,?et?al.?1991.?Proc?Natl?Acad?Sci?USA.?88:?10558-10562）。

長(zhǎng)期以來(lái)，選擇標(biāo)記基因及其產(chǎn)物是否會(huì)對(duì)環(huán)境或人類(lèi)健康產(chǎn)生影響，引起了人們廣泛關(guān)注。為解決可能因選擇標(biāo)記引起的安全問(wèn)題，一些科學(xué)家采用了較為安全的基因作為選擇標(biāo)記，如6-磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因（pmi）、木糖異構(gòu)酶基因（xy1A）等。但這種替換策略仍未能完全消除人們對(duì)選擇標(biāo)記基因的安全性疑慮。從根本上講，徹底刪除轉(zhuǎn)基因植物中的選擇標(biāo)記基因，培育無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物，才是解決選擇標(biāo)記安全性顧慮的最根本策略。

無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物的研究和培育已成為國(guó)際上植物基因工程領(lǐng)域的一個(gè)趨勢(shì)。在水稻系統(tǒng)中，位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)介導(dǎo)法是培育無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植株的主要方法之一（Sreekala,?et?al.?2005.?Plant?Cell?Rep.?24:?86-94；趙艷等，2011，中國(guó)水稻科學(xué)，25：580-586）。但目前應(yīng)用于水稻中的分子刪除系統(tǒng)效率比較低，且需要在組織培養(yǎng)階段進(jìn)行誘導(dǎo)處理，不利于規(guī)?；僮?。鑒于此，本發(fā)明利用化學(xué)誘導(dǎo)表達(dá)XVE系統(tǒng)（Zuo,?et?al.?2000.?Plant?J.?24:?265-273）控制Cre重組酶表達(dá)，同時(shí)采用改進(jìn)型位點(diǎn)特異識(shí)別序列l(wèi)oxP-FRT（Luo,?et?al.?2007.?Plant?Biotechnol?J.?5:?263-274），其能夠更高效介導(dǎo)位點(diǎn)特異性重組。在此基礎(chǔ)上，首次建立了一個(gè)在植株水平上高效率刪除轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)記基因的方法。這一方法避免了常規(guī)策略需要在組培階段進(jìn)行誘導(dǎo)處理的局限性，尤其適合大規(guī)模培育無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種利用化學(xué)誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)在植株水平上高效率刪除轉(zhuǎn)基因水稻選擇標(biāo)記基因的方法，同時(shí)也提供一種化學(xué)誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性高效重組系統(tǒng)的新型水稻遺傳轉(zhuǎn)化載體。這一方法避免了常規(guī)策略需要在組培階段進(jìn)行誘導(dǎo)處理的局限性，尤其適合大規(guī)模培育無(wú)選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因水稻。該載體中，選擇標(biāo)記基因位于兩個(gè)同向位點(diǎn)特異性識(shí)別序列之間，目的基因結(jié)構(gòu)位于兩個(gè)位點(diǎn)特異性識(shí)別序列之外。在本發(fā)明所述原載體中，位點(diǎn)特異性識(shí)別序列是loxP-FRT融合序列，原載體可以用于組裝其它高效位點(diǎn)特異性重組酶識(shí)別序列；原載體中選擇標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?i>hpt，原載體可以用于組裝其它選擇標(biāo)記基因；原載體中目標(biāo)基因?yàn)閳?bào)告基因GUS，原載體可以用于組裝其它有應(yīng)用價(jià)值的基因，包括抗蟲(chóng)基因、抗病基因、抗除草劑基因、抗逆基因、抗衰老基因、品質(zhì)功能改良基因以及由上述基因組成的融合或多價(jià)基因。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：包括以下步驟：

a.???????構(gòu)建化學(xué)誘導(dǎo)型位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的水稻轉(zhuǎn)化載體，其中選擇標(biāo)記基因位于兩個(gè)同向位點(diǎn)特異性識(shí)別序列之間，目的基因結(jié)構(gòu)位于兩個(gè)位點(diǎn)特異性識(shí)別序列之外；

b.??????利用該轉(zhuǎn)化載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法，轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，篩選、分化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因水稻植株；

c.???????種植轉(zhuǎn)基因水稻植株，收獲自交結(jié)實(shí)種子；

d.??????浸種、催芽過(guò)程中，經(jīng)過(guò)化學(xué)誘導(dǎo)處理所收獲種子，誘導(dǎo)位點(diǎn)特異性識(shí)別序列產(chǎn)生重組，介導(dǎo)選擇標(biāo)記基因發(fā)生刪除；

e.???????種植并檢測(cè)經(jīng)處理萌發(fā)的幼苗，進(jìn)一步分子檢測(cè)轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)的重組行為，獲得選擇標(biāo)記基因被刪除的轉(zhuǎn)基因水稻幼苗。?

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明創(chuàng)建了一種水稻化學(xué)誘導(dǎo)型高效分子刪除系統(tǒng)。采用改進(jìn)型高效位點(diǎn)特異識(shí)別序列，其可以顯著提高化學(xué)誘導(dǎo)刪除選擇標(biāo)記基因的效率。