[發(fā)明專利]一種發(fā)酵生產(chǎn)重組牛虻抗血栓酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310560274.1
• 申請日: 2013-11-12
• 公開（公告）號: CN104630191A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 秦引林;莊韜
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇柯菲平醫(yī)藥股份有限公司
• 主分類號: C12N9/68
• 分類號: C12N9/68;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種發(fā)酵生產(chǎn)牛虻抗血栓酶的方法，包括：(1)構(gòu)建含牛虻抗血栓酶目的基因的高效表達(dá)工程菌株，(2)一級種子的培養(yǎng)，(3)二級種子的培養(yǎng)，(4)上罐發(fā)酵，(5)離心發(fā)酵液收集菌泥，進(jìn)行純化，其特征在于，在上罐發(fā)酵過程中，參數(shù)設(shè)置為pH值為6.5-7.5，溶氧值為不小于20％，生長溫度為30℃-37℃，誘導(dǎo)期溫度為25℃-37℃。

2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)牛虻抗血栓酶的方法，其中，將kfpase基因正確置于大腸桿菌表達(dá)載體pet30a，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)篩選建立分泌表達(dá)kfpase的工程菌株。

3.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)牛虻抗血栓酶的方法，其中，一級種子的制備，挑取平板種子接種到三角瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為LB，37℃，200rpm，培養(yǎng)7-9h，OD600為1-2。

4.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)牛虻抗血栓酶的方法，其中，二級種子的制備，以1％接種量接種三角瓶培養(yǎng)基，培養(yǎng)基為LB，37℃，200rpm，培養(yǎng)14-18h，OD600為3-5。

5.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)重組牛虻抗血栓酶的方法，其中，上罐發(fā)酵過程中：

(1)4.5發(fā)酵培養(yǎng)基組成

稱取glucose22.5g，yeast?extract49.5g，tryptone85.5g，MgSO₄4.5g，KH₂PO₄13.5g，K₂HPO₄·3H₂O81g，(NH₄)₂SO₄18g，溶于4L水中，定容4.5L；

(2)待發(fā)酵罐滅菌，降溫至37℃，調(diào)整參數(shù)，PH值為7.0，按2％的接種量接種；

(3)生長階段，在基礎(chǔ)料中生長3-5h，待培養(yǎng)基中的初始糖耗盡后，補(bǔ)50％葡萄糖溶液4-6h；

(4)誘導(dǎo)期，停止補(bǔ)葡萄糖，待葡萄糖耗盡，溶氧上升，PH回升后，添加終濃度為0.1mM-0.8mM的IPTG。通過50％葡萄糖溶液的間歇流加來控制pH值穩(wěn)定在7.0左右；

(5)發(fā)酵過程中，工藝參數(shù)的控制為：pH值為6.5-7.5，溶氧值為不小于20％，生長期溫度和誘導(dǎo)期溫度為37℃。

6.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵生產(chǎn)重組牛虻抗血栓酶的方法，其中，將發(fā)酵液離心，收集菌泥，進(jìn)行純化。