[發明專利]一種碳納米管復合基因載體系統及其制備方法

有效

• 申請號: 201310558175.X
• 申請日: 2013-11-11
• 公開（公告）號: CN103877580A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發明（設計）人: 金一;孔芬芬;沈松;王成潤
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: A61K47/32
• 分類號: A61K47/32;A61K47/34;A61K47/02;A61K48/00;A61P35/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;冷紅梅

（一）技術領域

本發明涉及一種碳納米管復合基因載體系統及其制備方法。

（二）背景技術

基因治療在先天性及后天性疾病的治療或預防中，為一項有前景的治療手段。目前，大部分基因的體內傳遞方式是靠病毒性載體或非病毒性載體。病毒性載體轉染效率雖高，卻存在一些缺陷，包括引起人體的炎癥及免疫反應。非病毒性載體包括聚陽離子脂質體、陽離子聚合物、納米粒子。雖然非病毒性載體的免疫原性較弱，但抵達和穿越核膜的能力也弱。因此，尋找一個低毒性、低免疫原性、高穿胞膜能力的基因載體，勢在必行。

碳納米管分為單壁碳納米管（SWNTs）和多壁碳納米管（MWNTs）。自1993年Ijima發現單壁碳納米管以來，單壁碳納米管（SWNTs）因其新穎獨特的結構、機械、電子特性在多種領域得到關注和應用。碳納米能任意彎曲，且修飾過的碳納米管能與細胞膜表面進行多點結合；比表面積大，側壁能有效攜載多個分子進入細胞，且幾乎無毒性。碳納米管在700～1100nm處的近紅外吸收的光學特性，使其應用于光熱治療或基因、化療、影像等多學科的綜合治療。且經過合適修飾后的碳納米管能以“分子針”的形式穿過胞核，且能到達細胞核，是一個具有良好前景的基因載體。

然而，碳納米管幾乎不溶于所有溶劑，且碳納米管含有催化劑和無定形碳，具有生物不溶性。以上兩點限制了其作為藥物載體在醫藥領域的應用。目前，已有較多關于修飾碳納米管以獲得良好溶解性及應用價值的研究報道，包括共價修飾方法以及非共價修飾。共價修飾通過對碳納米管頭端以及側壁的化學反應使其接上親水基團；共價修飾雖能極大增加碳納米管的溶解度，但卻會破壞碳納米管的結構。而非共價修飾的方法能避免以上缺點。為此，本發明著力于尋找非共價修飾碳納米管，力圖設計出一種高水溶性、低毒性、高穩定性及生物相容性、高轉染效率的基因載體系統。

（三）發明內容

本發明的目的是構建一種通過非共價修飾的手段獲得陽離子的碳納米管復合系統，此方法簡單、易行和高效，且極大增溶了碳納米管，并獲得了高生物相容性、低毒性、高轉染效率的基因載體。

本發明采用的技術方案是：

一種碳納米管復合基因載體系統，由碳納米管（包括單壁碳納米管和多壁碳納米管）管壁上通過疏水作用結合聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物（PEI-Chol）和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺（DSPE-PEG）得到，具體由如下方法制得：稱取質量之比為1：10～50：1～2的碳納米管、聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入適量去離子水，300～600w功率超聲波清洗20～60min，得到碳納米管分散液；將碳納米管分散液10000～13000rpm轉速離心取上清液，重復離心，收集上清液于100kDa的離心過濾器中，4000rpm離心30～40min，取膜上濃縮液，用去離子水定容，即得所述碳納米管復合基因載體系統的溶液。

所述聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物（PEI-Chol）具體可由如下方法制得：稱取聚乙烯亞胺，加入適量無水二氯甲烷（用分子篩脫水）和三乙胺的混合溶液，冰浴攪拌混合均勻得到PEI溶液；稱取酰氯膽固醇溶于冰無水二氯甲烷中，將此溶液緩慢滴加到上述PEI溶液中，30min內滴加完畢；混合物在冰浴條件下繼續攪拌反應12h。反應后的溶液轉移至茄形瓶中，旋轉蒸發出去溶劑，所得的產物經真空干燥后，加入HCl（0.1M）溶液溶解，并用二氯甲烷萃取數次，以除去未反應的酰氯膽固醇；萃取后的水溶液經過冷凍干燥后得到白色粉末，即PEI-ChoL。所述的聚乙烯亞胺的分子量為0.6kDa～25kDa，優選為0.6KDa～10KDa；聚乙烯亞胺與酰氯膽固醇的投料質量之比為1000：20～2000，所述DSPE-PEG優選為DSPE-PEG₂₀₀₀。所述的聚乙烯亞胺為PEI600，PEI1800，PEI10000或PEI25000時，與膽固醇甲酰氯的質量之比分別為1000：1000～2000，1000：330～660，1000：60～120，或1000：24～48。

本發明還涉及一種制備所述碳納米管復合基因載體系統的方法，所述方法如下：稱取質量之比為1：10～50：1～2的碳納米管、聚乙烯亞胺-膽固醇共聚物和聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺，加入適量去離子水，300～600w功率超聲波清洗20～60min，得到碳納米管分散液；將碳納米管分散液10000～13000rpm轉速離心取上清液，重復離心，收集上清液于100kDa的離心過濾器中，4000rpm離心30～40min，取膜上濃縮液，用去離子水定容，即得所述碳納米管復合基因載體系統的溶液。