[發(fā)明專利]一種鯉春病毒標準樣品及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310557758.0
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103555860A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 吳斌;肇慧君;蔡曉萍;張雪
• 申請（專利權）人: 吳斌;肇慧君;蔡曉萍;張雪
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發(fā)明屬于檢測用病毒培養(yǎng)物標準品及其制備方法技術領域，具體涉及鯉春病毒標準樣品及其制備方法。

背景技術

我國是世界上最大的水產(chǎn)品生產(chǎn)和輸出國，目前，我國水產(chǎn)品總量已占全球漁業(yè)總產(chǎn)量的40%，連續(xù)15年居世界首位，養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%。水產(chǎn)品在保障國家糧食安全、促進農(nóng)民增收和農(nóng)村經(jīng)濟穩(wěn)步發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。我國水海產(chǎn)品出口面臨的壁壘主要為綠色壁壘，如日本的“肯定列表制度”、歐盟的《歐盟食品及飼料安全管理法規(guī)》及有關法令、美國的《最嚴謹?shù)乃a(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)范》（BAP）等，歐盟啟動了對我國進口人工養(yǎng)殖海產(chǎn)品的審查；韓國政府也禁止我國34家水產(chǎn)養(yǎng)殖企業(yè)向韓國出口魚類等水產(chǎn)品，嚴重制約了我國水產(chǎn)品的出口增長。

鯉春病毒病(又稱鯉魚傳染性腹水癥)是由鯉春病病毒（SVC）感染而引起鯉魚科的一種急性、出血性傳染性病，是對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)危害較大的一種傳染性疫病。也是我國動物防疫法規(guī)定的一類動物疫病，OIE將其列為需要向OIE申報的疫病。該病原廣泛存在，傳播速度快，潛伏期短，死亡率高，可導致整個魚塘毀滅性打擊，且該病毒傳播快且比較難控制疫情，是水生動物檢疫中嚴格檢驗控制的病毒。鯉春病毒血癥的流行地域廣，流行于歐洲、中東和俄羅斯，主要有奧地利、匈牙利、保加利亞、法國、德國、英國、意大利、西班牙以及捷克、斯洛伐克、俄羅斯等，近幾年逐步蔓延到美洲和亞洲。該病是魚類口岸檢疫的第一類檢疫對象，可引起各國的貿(mào)易摩擦和巨大的經(jīng)濟損失。1998年英國從北京進口一批觀賞魚中檢出含有鯉春病病毒，并以此要求中國對所有出口觀賞魚飼養(yǎng)場進行兩年以上的凈化及SVC監(jiān)測，直至保證沒有SVC，方可向英國出口。隨后，中國觀賞魚出口的傳統(tǒng)市場法國、意大利、西班牙、比利時、日本和新加坡等也相繼提出了類似要求。后經(jīng)英國有關專家證實，北京并未發(fā)現(xiàn)任何SVC感染情況。但是，我國卻為此損失創(chuàng)匯1億多元，而且全國的觀賞魚產(chǎn)業(yè)從此一落千丈。2002年美國北卡羅來納州發(fā)生該病導致15萬尾錦鯉的損失，同年6月美國威斯康星州的野生鯉魚也大量發(fā)病。2003、2005、2007年英國在本地均檢出SVCV。中國養(yǎng)殖鯉魚占淡水魚21%，養(yǎng)殖歷史悠久，但未見該病暴發(fā)的正式報道，該病一旦發(fā)病，將給我國養(yǎng)殖漁業(yè)以沉重的打擊。

由于養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境惡化，疾病預防意識差，濫用藥物普遍，水生動物種苗質量不高，防疫體系不健全等原因導致水生動物發(fā)病。系統(tǒng)內(nèi)送檢魚的樣品通常眼觀來看都比較健康，而鯉春病毒通常只有在適宜的溫度下才能發(fā)病，而且現(xiàn)在用的PCR方法只能從重度感染表現(xiàn)出臨床癥狀的魚中檢出病毒，無法檢測潛在的病毒。隨著進出口貿(mào)易的增大，檢驗流程時限要求縮減，魚類疫病多數(shù)要上細胞進行先增殖，而普通的水生動物疫病實驗室很難得到該病毒，對實驗室的質量控制及研究帶來了極大的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述技術問題，幫助實驗室建立好的質量保證，遼寧出入境檢驗檢疫局從2006年就開始從事水生動物疫病及標準樣品的研究工作，成立了研制標準樣品工作小組，由遼寧出入境檢驗檢疫局制備測試樣品，使用的鯉春病毒株SVCV-DL來源于日常搜集樣品。進行了原材料的選取、標準樣品的制備、均勻性和穩(wěn)定性檢查、定性檢定、定值等項工作。

本標準樣品的研制成功，不僅為檢測研究、醫(yī)藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構技術指導、服務出口企業(yè)提供技術上的支持。

本發(fā)明的一方面在于：公開一種鯉春病毒標準樣品的制備方法，其包括以下操作步驟：

a.病毒的增殖

選長滿單層的EPC細胞，倒掉培養(yǎng)液，接種SVC病毒液；于15℃吸附2小時；補加M199維持液，繼續(xù)培養(yǎng)至細胞病變達到80%以上，收獲病毒培養(yǎng)物，于-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

b.凍干工藝

凍干保護劑為：按以下組分和重量體積比配制而成：海藻糖：去離子水為5%，脯氨酸：去離子水為5%，脫脂奶粉：去離子水為10%；

凍干工藝為：取步驟a中病毒培養(yǎng)物與凍干保護劑按等體積比均勻混合，于-30℃中預凍24h后，移至凍干機中，保持真空度在30～40mtorr間，真空干燥24h，即為鯉春病毒標準樣品。

對于上述技術方案中，所述的鯉春病毒標準樣品的制備方法，其步驟a所述收獲病毒培養(yǎng)物為：待EPC細胞感染SVC病毒后脫落，出現(xiàn)細胞病變后反復凍融細胞培養(yǎng)物三次，于4℃，10000r/min離心10min制備獲得。

對于上述技術方案中，所述的鯉春病毒標準樣品的制備方法，其步驟b所述凍干保護劑經(jīng)過108℃,15min滅菌。