[發明專利]傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品及其制備方法

有效

• 申請號: 201310554941.5
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103614342A
• 公開（公告）日: 2014-03-05
• 發明（設計）人: 吳斌;肇慧君;胡強;宋立奇
• 申請（專利權）人: 吳斌;肇慧君;胡強;宋立奇
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 賈漢生;李馨

技術領域

本發明屬于檢測用病毒培養物標準品及其制備方法技術領域，具體涉及IPNV標準樣品及其制備方法。

背景技術

傳染性胰臟壞死病病毒(Infectious?Pancreatic?Necrosis?Virus，IPNV)，為雙股核糖核酸類型，病毒顆粒呈六角形或近似圓形，20面體，直徑50-72納米，少數可大到75-110納米，有單層衣殼，沒有囊膜，有92個殼粒。對乙醚、氯仿等脂溶劑、胰酶及乙二胺四乙酸不敏感，對甘油也很穩定，對熱和酸穩定。可以在多種冷水性魚類的細胞株中增殖，并使細胞產生病變；而在溫水性魚類的細胞株中不增殖，也不出現細胞病變。敏感細胞接種病毒后，在15℃-25℃均能出現細胞病變，最適溫度為15-20℃。該病毒現有VR299、Sp、Ab、He等不同血清型。傳染性胰臟壞死病（Infectious?Pancreatic?Necrosis，IPN）是由傳染性胰臟壞死病病毒(Infectious?Pancreatic?Necrosis?Virus，IPNV)引起的危害極其嚴重的一種魚病，該病是世界性魚病，主要危害溪鱒、虹鱒、克氏鮭、紅克鮭、銀大馬哈魚、枇杷鱒、紅大馬哈魚等魚苗和幼魚。最早發生在加拿大、美國，后來在丹麥、法國、希臘、英國、德國、挪威、意大利、瑞典、日本等國發生流行，本世紀80年代又傳入朝鮮、我國臺灣省及東北、山西、山東、甘肅等養殖虹鱒地區。在我國山西省某虹鱒養殖場于1986年和1987年有過二次大流行，造成90％的虹鱒稚魚死亡，東北地區也有過流行。該病往往屬于急性流行，死亡率高達50％-100％，而20周齡以上的幼魚一般不發病。此病常在水溫10℃-15℃時流行，10℃以下或15℃以上發病少，而且病情較輕，死亡率低。發病后殘存未死的，可數年以上用到終身成為帶毒者，并通過糞例、魚卵、精液排出病毒，繼續傳播。自80年代該病傳入我國以來，隨著進出口貿易的急劇增加，IPNV已經成為口岸水生動物及其產品的檢疫對象。

實驗室的質量控制一直是人們關注的事情，傳染性胰臟壞死病已有國際或國內的標準方法。然而標準方法的使用并不總能保證測試結果的良好的重復性，針對內部質量控制，許多實驗室使用自己的標準樣品，這種樣品制備特別費時，進一步來講個體的內部標準樣品與不同的實驗室結果的比對是不可能的。為了幫助實驗室完成好的質量保證，遼寧出入境檢驗檢疫局從2005年就開始做這項工作。本標準樣品的研制成功，不僅為檢測研究、醫藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構技術指導、服務出口企業提供技術上的支持。

發明內容

本發明的技術方案為，先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經特異性PCR方法及ELISA試驗檢測，通過特異序列測定分析后，進行病毒增殖和TCID₅₀滴度測定，再通過病毒培養物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩定性測試后，進行定值即為成品。

本發明所涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的來源是：遼寧地區實驗室分離株，IPNV毒株由遼寧出入境檢驗檢疫局的實驗室分離保存，毒株名稱：IPNV-DL。（發表的相關文章：胡曉利，李偉，肇慧君，吳斌.虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定[J].中國動物檢疫，2012,29（3）：27-30）。

本發明為了完成本項標準樣品的制備工作，遼寧出入境檢驗檢疫局成立了研制工作小組，IPNV標準樣品制備工藝流程見圖1。

本發明一方面涉及一種傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其步驟包括：

a.IPNV-DL毒株感染CHSE-214細胞獲得病毒增殖液；

b.將步驟a中獲得的病毒增殖液低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；

c.檢測步驟b中獲得的混合凍干粉樣品均勻性、穩定性后定值并分裝。

本發明的上述技術方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，步驟a包括：將已長滿單層的CHSE-214細胞用0.05%胰酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的M199培養基中，以1～2×10⁶個細胞/細胞瓶分裝，待細胞長至培養單層80%面積時，倒掉含10%胎牛血清的M199培養基，加入200μL步驟a中的感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液的上清液，20℃感作1h，再用無血清的M199培養基清洗兩次，覆蓋含1%甲基纖維素、2%血清的M199維持液；20℃低溫培養箱繼續培養，直至細胞病變達到80%時，反復凍融3次后，4℃,10000rpm，離心10min，得上清液即為IPNV-DL病毒增殖液；