[發(fā)明專利]一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310552573.0
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN103882104A
• 公開（公告）日: 2014-06-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉慶龍;唐景春;朱文英;張海榮;孫克靜;劉英
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境石油污染監(jiān)測領(lǐng)域，具體地說是一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法。?

背景技術(shù)

石油是推動社會發(fā)展的重要能源，但是每年全世界約有1×10⁹t石油及其產(chǎn)品在石油開采、煉制、貯運(yùn)、使用以及各種泄露事故中進(jìn)入地下水、地表水和土壤，其中我國占60多萬噸，直接造成我國面積500萬公頃土壤受石油污染，石油組分中的芳香烴組分含有致癌、致畸、致突變毒性，給當(dāng)?shù)貛碇参餃p產(chǎn)、糧食安全隱患、生態(tài)環(huán)境破壞等一系列嚴(yán)重問題。?

綠色經(jīng)濟(jì)高效的生物降解石油途徑引起了國內(nèi)許多學(xué)者研究和倡導(dǎo)，但是傳統(tǒng)微生物篩選培養(yǎng)的方法只能分離占石油降解菌總數(shù)的1％～10％的微生物種類，根本無法體現(xiàn)微生物的真實(shí)降解水平和反映土壤中微生物多樣性及分布。此外，芳香烴降解基因BTEX能編碼代謝芳香烴重要的末端氧化酶已有很多研究和報(bào)道，但是他們在引物設(shè)計(jì)上往往受到降解菌類型的限制，合成的代謝酶不能代表大部分的降解菌所含的基因類型。?

近十年興起的分子生物學(xué)技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)能避免傳統(tǒng)平板培養(yǎng)方式的弊端，直接對提取土壤微生物總DNA進(jìn)行分析，通過熒光染料和目標(biāo)DNA在延伸過程結(jié)合所產(chǎn)生的熒光信號的強(qiáng)度，對關(guān)鍵的石油烴生物降解基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量測定，在國內(nèi)外微生物種群的多樣性和群落分布監(jiān)測分析上有重要的應(yīng)用。該技術(shù)在石油降解基因特異性擴(kuò)增所需引物的合成上，對大部分能降解石油烴的菌株序列進(jìn)行比對，設(shè)計(jì)同源性較高的石油烴降解基因擴(kuò)增引物。此外，實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)不用專門設(shè)計(jì)檢測探針，具有比其他分析技術(shù)如雜交和克隆更加簡便、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確。?

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目在于提供一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，可以對降解微生物的芳香烴代謝途徑和降解活性進(jìn)行準(zhǔn)確檢測，又能反映土壤石油污染程度。?

本發(fā)明的技術(shù)方案：?

一種石油污染土壤中萘降解基因Nah含量的測定方法，主要步驟如下：?

1)采集石油污染0～20cm表層土壤進(jìn)行-20℃保存，按照ZR?Soil?Microbe?DNA?MiniPrep^TM土壤DNA提取試劑盒步驟進(jìn)行DNA提取。?

2)引物設(shè)計(jì)遵循引物設(shè)計(jì)原則，從土壤中能降解石油烴的菌株序列中比對設(shè)計(jì)同源性較高的萘降解基因擴(kuò)增引物Nahf/Nahr，見下表。?

3)將提取凈化后的DNA經(jīng)過PCR儀(Techne?TC5000)進(jìn)行Nah降解基因特異性擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)過2.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測是否是目的片段。?

4)按照AxyPrep?DNA凝膠回收試劑盒的操作步驟進(jìn)行切膠回收目的基因，按照pEASY-T1Clonning?Kit步驟將目的基因?qū)隩rans-T1感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后涂有20mg/ml?X-gal和100mg/ml氨芐青霉素平板上進(jìn)行藍(lán)白斑陽性克隆子的篩選。?

5)挑選白色菌落培養(yǎng)后的載體細(xì)胞經(jīng)過Plasmid?Mini?Kit質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的提取，對獲得的質(zhì)粒經(jīng)過Nah降解基因特異性PCR后上2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用微量核酸蛋白質(zhì)分析儀測定所提質(zhì)粒的拷貝數(shù)。?

6)將所提質(zhì)粒中含有目的基因Nah的DNA模板依次稀釋10倍梯度進(jìn)行熒光定量PCR(BioRad?CFX96)完成外標(biāo)曲線的建立，同時(shí)將不同的石油污染樣品DNA進(jìn)行熒光定量PCR，溫度程序?yàn)椋?5℃保持5min；經(jīng)過以下40個(gè)周期：變性溫度為94℃，保持5s，退火溫度57℃，保持60s，后經(jīng)過72℃的延伸30s。熔解曲線溫度：Nah基因從57℃保持5s，然后逐漸升到95℃(增量為0.5℃)?

7)根據(jù)建得的外標(biāo)曲線測定供試土樣中萘降解基因Nah拷貝數(shù)，空白為不加DNA的陰性對照，做三個(gè)平行。?

8)檢測限為建立外標(biāo)曲線時(shí)，熒光信號和稀釋目標(biāo)DNA濃度不成線性比例時(shí)，所得到對應(yīng)目的基因拷貝數(shù)。?

熒光定量PCR體系如下：?

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：?

(1)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)避免傳統(tǒng)培養(yǎng)生物技術(shù)分析不全面的缺點(diǎn)，直接對土壤微生物總DNA進(jìn)行提取，能對關(guān)鍵的石油烴生物降解基因拷貝數(shù)進(jìn)行定量測定，準(zhǔn)確反映污染地區(qū)中石油烴的生物降解途徑和代謝活性，反映降解菌的群落組成和變化，促進(jìn)和監(jiān)督綠色環(huán)保高效的生物修復(fù)技術(shù)在石油烴修復(fù)中的應(yīng)用。?