[發明專利]肺炎支原體23S rRNA 2063位點A:G突變檢測特異性引物和探針

有效

• 申請號: 201310550380.1
• 申請日: 2013-11-08
• 公開（公告）號: CN104630329A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 李楊霞;杜君卿
• 申請（專利權）人: 江蘇默樂生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/35
• 代理公司: 泰州地益專利事務所 32108
• 代理人: 王楚云

?

技術領域

本發明是一種用于檢測肺炎支原體23S?rRNA?2063位點A:G突變的特異性引物和探針。

?

背景技術

肺炎支原體（Mycoplasma?pneumoniae，MP）是一種常見的呼吸道病原體，通常導致輕微的上呼吸道感染，如喉嚨痛、咽喉炎和氣管炎，其引起的肺炎占非細菌性肺炎的50%，還可引起肺外并發癥，累及一個或多個系統、器官，如皮膚、胃腸道、心血管、骨骼肌肉和腎臟，嚴重時可致中樞和外周神經系統病變，甚至死亡。通過飛沫以氣溶膠形式傳播，存留在鼻、喉、氣管和痰液中，密切接觸可能引起肺炎支原體的暴發。肺炎支原體無細胞壁，因此，對影響細胞壁合成的抗生素如青霉素等不敏感，但是，對影響細菌蛋白合成的抗生素如大環內酯類、喹諾酮類等敏感。大環內酯類是治療肺炎支原體感染的首選藥物，可結合于肺炎支原體核糖體50S亞基的轉肽酶中心與肽輸出通道之間的部分，通過機械阻塞通道而抑制肽鏈的延伸，從而達到抑制蛋白合成的目的，其結合位點由23S?rRNA結構域Ⅴ的核苷酸構成，其中2063位點是主要的組成部分。近年來，隨著大環內酯類抗生素的廣泛使用，臨床分離出了耐藥菌株，提示肺炎支原體耐藥現象的存在。國內外的研究表明，產生耐藥的肺炎支原體在23S?rRNA序列上發生點突變，其中，最常見的是2063位點A到G的突變。

目前，臨床上對肺炎支原體耐藥性的檢查，主要是依靠肺炎支原體的分離及藥敏實驗，由于肺炎支原體分離較為困難，所以靈敏度較低，而且耗時耗力，不利于及時指導用藥。本發明采用的熒光PCR技術，操作簡便、檢測迅速、檢出率高，通過一次試驗即可明確是否有耐藥肺炎支原體的感染，有利于對疾病進行及時診斷及合理選擇治療方案，與傳統分離培養檢測技術相比，提高了檢出效率、降低了漏檢率。可對多種臨床樣本進行高效可靠的篩查，以及對臨床病情和用藥效果進行監測，指導合理用藥。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于檢測肺炎支原體23S?rRNA?2063位點A:G突變的引物和探針。

基于上述目的，本發明采用以下技術方案。

用于檢測檢測肺炎支原體23S?rRNA?2063位點A:G突變的特異性引物和探針序列包括：上游引物MPF序列為5’?TGT?AAC?CNT?CTC?TTG?NCT?GTC?T?3’，下游引物MPR序列為5’?CGA?TTN?CTC?CTA?CCT?NTT?CTC?TA?3’和探針2063P序列為?5’FAM?CGG?GGT?CNT?CNC?GTC?CC?BHQ1?3’。

本發明的具體原理是利用一對靶核酸序列的特異性引物和探針，采用實時熒光定量PCR技術，通過PCR實現靶核酸序列片斷的擴增。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團（R）和熒光淬滅基團（Q）的寡核苷酸。在探針完整時，報告基團發出的熒光被淬滅基團吸收，在PCR擴增過程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性將特異結合在靶核苷酸片斷上的熒光探針酶切降解，使報告基團的熒光信號可以被檢測，熒光信號量的變化與擴增產物量成正比，從而可以通過熒光強弱來判斷待測樣本中靶核苷酸序列的存在。

?

附圖說明

圖1是利用引物對MPF/MPR和探針2063P檢測肺炎支原體23S?rRNA?2063位點A:G突變陽性樣本的熒光PCR擴增圖。

?

具體實施方式

1.??????引物和探針的設計：通過分別對所有已知的肺炎支原體23S?rDNA序列進行比較分析，選擇2063位點所在區段，設計多對引物和探針，引物長度一般為20堿基左右。最優引物探針序列組合如下：

上游引物MPF：?5’?TGT?AAC?CNT?CTC?TTG?NCT?GTC?T?3’

下游引物MPR：?5’?CGA?TTN?CTC?CTA?CCT?NTT?CTC?TA?3’

探針2063P????：?5’??FAM?CGG?GGT?CNT?CNC?GTC?CC?BHQ1?3’。

2.?反應體系的優化：利用臨床分離的耐藥肺炎支原體滅活液作為待檢樣品，用磁珠裂解法抽提肺炎支原體核酸，分裝后貯存于－80℃。

2.1?引物濃度的優化?在反應體系中其它條件相同的情況下，將肺炎支原體引物濃度分別從0.1μmol/L至1.6μmol/L作倍比連續稀釋，通過對試驗結果的分析比較，確定最佳引物濃度是0.2μmol/L。