[發明專利]磷脂酶C突變體及其用途

有效

• 申請號: 201310548632.7
• 申請日: 2013-11-07
• 公開（公告）號: CN104630174B
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 許駿;宣姚吉;李金敏
• 申請（專利權）人: 豐益（上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/81;C12N1/19;C11B3/00;C12R1/085;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本申請提供了蠟樣芽胞桿菌的野生型磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C的突變體，涉及的突變包括第63位的天冬酰胺突變為其他氨基酸，還可以包括第20位的精氨酸至組氨酸以及第83位的丙氨酸至天冬氨酸的突變。本申請還提供了編碼所述突變體的核酸分子、包含所述核酸分子的載體以及包含所述核酸分子或載體的細胞。本申請還提供了所述突變體、核酸分子載體以及細胞的用途。

發明領域

本申請涉及磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C突變體及其用途。

發明背景

脫膠是油脂精煉的重要步驟，傳統的水化脫膠法經濟成本高，物料能耗大，環境污染重，所以近些年來，很多工作致力于將酶法脫膠用于油脂精煉中的脫膠環節。同傳統方法相比，酶法脫膠能夠提高經濟效益，實現節能減排，對生態環境污染少，在環保、經濟、質量等方面具有較大的優勢。油脂脫膠中所用的一種酶為磷脂酶。同其他脫膠酶相比，磷脂酶C(PLC)表現出更大的優勢，例如，增加甘二酯(DAG)的得率，以及減少得油量的損失。

蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)的磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(BC-PC-PLC)是研究較早的一種磷脂酶C。BC-PC-PLC全長為283個氨基酸，其中包含24個氨基酸的信號肽和14個氨基酸的前導肽，成熟肽為245個氨基酸(參見，例如Johansen,T.,Holm,T.,Guddal,P.H.,Sletten,K.,Haugli,F.B.,Little,C.(1988).Cloning and sequencing of thegene encoding the phosphatidylcholine-preferring phospholipase C of Bacilluscereus.Gene65(2):293-304)。

BC-PC-PLC的晶體結構已有報道，其由多個螺旋結構域組成，催化位點為55位天冬氨酸，并且含有至少三個Zn²⁺結合位點(參見，例如Hough.,E.,Hansen,L.K.,Birknes,B.,Jynge,K.,Hansen,S.,Hordvik,A.,Little,C.,Dodson,E.,Derewenda,Z.(1989)High-resolution(1.5A)crystal structure of phospholipase C from Bacillus cereus.Nature.338:357-60)。BC-PC-PLC的異源表達研究較少，已有報道涉及在枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和畢赤酵母(pichia pastoris)中表達BC-PC-PLC(參見，例如Durban,M.A.,Silbersack,J.,Schweder,T.,Schauer,F.,Bornscheuer,U.T.(2007)Highlevel expression of a recombinant phospholipase C from Bacillus cereus inBacillussubtilis.Appl Microbiol Biotechnol74(3):634-639;以及Seo,K.H,Rhee J.I.(2004)High-level expression of recombinant phospholipase C from Bacilluscereus in Pichia pastoris and its characterization.Biotechnol Lett26(19):1475-1479)。

本領域中需要改進的(例如酶活性更高的)磷脂酶C。

發明概述

第一方面，本申請提供了具有磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C活性的多肽，所述多肽包含突變的SEQ ID No:2所示的氨基酸序列或其活性片段，其中所述突變包括將SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的第63位的天冬酰胺進行突變。