[發(fā)明專利]一種酵母菌分離、篩選的方法及生防菌劑的制備方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310547291.1
• 申請(qǐng)日: 2013-11-06
• 公開（公告）號(hào): CN103740807A
• 公開（公告）日: 2014-04-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蒲金基;張賀;陳照;劉曉妹;漆艷香;張欣;喻群芳;陸英;謝藝賢
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;A01N63/04;A01P3/00
• 代理公司: 北京科億知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，該酵母菌分離、篩選的方法包括以下步驟：

步驟一、通過酵母宏觀培養(yǎng)特征、酵母菌落形態(tài)觀察、假菌絲的形成、酵母菌子囊孢子的觀察、擲孢子鏡檢對(duì)酵母形態(tài)學(xué)鑒定；

步驟二、通過采用杜氏管發(fā)酵法、碳源同化采用液體培養(yǎng)法、氮源同化、接種于NYDA斜面35℃下生長(zhǎng)情況、致死溫度和耐乙醇能力，對(duì)生長(zhǎng)曲線測(cè)定，實(shí)現(xiàn)生理生化指標(biāo)的測(cè)定；

步驟三、通過酵母菌4-4A總DNA的提取、rDNA-ITS區(qū)域PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物回收純化、產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆檢測(cè)、ITS片段測(cè)序及分析，實(shí)現(xiàn)ITS序列的分析。

2.如權(quán)利要求1所述的酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，步驟一的具體方法如下：

第一步，酵母宏觀培養(yǎng)特征

先將酵母菌接在NYDA斜面上，25℃培養(yǎng)2天～3天活化，然后取菌體1環(huán)接入含40mlNYDB液體培養(yǎng)基的100ml三角瓶中，25℃恒溫靜置培養(yǎng)3天；

第二步，酵母菌落形態(tài)觀察

將菌株活化培養(yǎng)2天～3天后，取一環(huán)接于NYDB培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)24小時(shí)，稀釋后涂平板于NYDA固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)3天；

第三步，假菌絲的形成

將倒好的PDA平板倒置1天～2天使其表面干燥，用活化好的酵母劃線接種2條～3條，蓋上滅菌的蓋玻片，28℃下培養(yǎng)5天后取蓋玻片觀察劃線兩旁假菌絲形成情況及形態(tài)；

第四步，酵母菌子囊孢子的觀察

將已活化的酵母菌株接種至Gorodkowa瓊脂培養(yǎng)基、豆芽汁葡萄糖培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3天，鏡檢子囊孢子形成情況，凡未見孢子的時(shí)間延長(zhǎng)至4周～6周，每周檢查子囊孢子出現(xiàn)情況；

第五步，擲孢子鏡檢

將倒好的PDA平板放置2天，然后將酵母菌株沿垂直直徑方向劃線接種，倒置放于另一個(gè)PDA平板上，放置一個(gè)無菌載玻片，將緊扣的兩個(gè)培養(yǎng)皿置于25℃培養(yǎng)三周，取出載玻片觀察載玻片上的孢子。

3.如權(quán)利要求1所述的酵母菌分離、篩選的方法，其特征在于，在步驟二中，生理生化指標(biāo)測(cè)定具體方法如下：

第一步，糖發(fā)酵

將需要測(cè)試的葡萄糖、半乳糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、菊糖、棉籽糖、松三糖8種糖用蒸餾水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)20％的母液，細(xì)菌過濾器過濾后放在4℃冰箱內(nèi)備用；

采用杜氏管發(fā)酵法，取口徑12mm的試管，每管加入7.2ml黃豆芽汁，將杜氏管倒置于大試管中包扎后121℃滅菌20min備用；分別于每支試管內(nèi)注入20％的糖母液0.8ml，并使小管內(nèi)外的糖擴(kuò)散均勻，再將酵母分別接種于含糖試管中，28℃靜置培養(yǎng)7天后觀察；凡不產(chǎn)氣的試管可延長(zhǎng)培養(yǎng)至10天再觀察，杜氏管內(nèi)有氣泡計(jì)為陽(yáng)性，無氣泡計(jì)為陰性；

第二步，碳源同化

采用液體培養(yǎng)法，在含0.5%碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，接入酵母種子液，濃度達(dá)到10⁴個(gè)/ml，以加入葡萄糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)液為對(duì)照，28℃振蕩培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況；

第三步，氮源同化

挑取底部較平整的滅菌培養(yǎng)皿，取20ml無氮源固體基礎(chǔ)培養(yǎng)基熔化，冷卻到50℃后注入酵母菌懸液1ml搖勻；待培養(yǎng)基凝固后，28℃倒置5小時(shí)；然后添加氮源并在培養(yǎng)皿底部標(biāo)記氮源名稱，28℃培養(yǎng)2天，觀察酵母菌的生長(zhǎng)情況，接種前，酵母菌需在無氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進(jìn)行饑餓培養(yǎng)；

第四步，35℃下生長(zhǎng)情況

將活化的酵母菌株劃線接種于NYDA斜面，35℃下培養(yǎng)3天～4天后觀察生長(zhǎng)情況；

第五步，致死溫度

將NYDB液體培養(yǎng)基裝入口徑12mm的試管中，每管4ml；再加入酵母菌液1ml，水浴加熱，溫度上升到預(yù)定值時(shí)計(jì)時(shí)10min；28℃過夜后涂板確定酵母是否全部死亡；從30℃開始，5℃為梯度遞增，直到酵母全部死亡的溫度，然后從上一個(gè)溫度以1℃遞增即可；

第六步，耐乙醇能力

向試管中加入NYDB液體培養(yǎng)基和無水乙醇，先加NYDB滅菌后再加無水乙醇；將酵母菌株的培養(yǎng)物稀釋后取1ml加入上述培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)3天～5天，在600nm下測(cè)定OD值；

第七步，生長(zhǎng)曲線測(cè)定

采用NYDB液體培養(yǎng)基，將酵母菌株活化，取兩環(huán)接種于50ml種子培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)24小時(shí)，取1ml種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接入的體積比為50ml/250ml，28℃，200r/min搖床培養(yǎng)，每2小時(shí)取樣稀釋20倍后在600nm吸光度下測(cè)定其OD值，根據(jù)時(shí)間和菌液濃度繪制酵母的生長(zhǎng)曲線圖。