[發(fā)明專利]蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310547219.9
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN103554216A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊大軍;余軍陽;韓志剛;周敏毅;阮乾坤;程永慶
• 申請（專利權(quán)）人: 北京三元基因工程有限公司
• 主分類號: C07K1/22
• 分類號: C07K1/22
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法。

背景技術(shù)

層析（chromatography），也稱為色譜，是分離純化蛋白質(zhì)最重要的手段。根據(jù)分離純化原理的不同，蛋白質(zhì)層析種類可以分為離子交換層析（ion?exchange?chromatography,IEC）、凝膠層析（gel?filtration?chromatography,GFC）或分子排阻層析（size?exclusion?chromatography,SEC）、疏水層析（hydrophobic?interaction?chromatography,HIC）與親和層析（affinity?chromatography,AC）等主要類別。

由于層析過程中引入的微生物、熱原（內(nèi)毒素）等物質(zhì)會污染層析獲得的蛋白質(zhì)，破壞、降解蛋白質(zhì)或影響蛋白質(zhì)作為藥物使用時的安全性；而蛋白質(zhì)本身又很容易污染微生物、熱原（內(nèi)毒素）等物質(zhì)引起層析系統(tǒng)的污染，進(jìn)而污染后續(xù)層析處理的蛋白質(zhì)，所以在每次層析填料使用后，下次層析填料使用前都優(yōu)選對層析填料進(jìn)行清潔處理，而在藥用蛋白質(zhì)的生產(chǎn)中在層析填料的每次使用后更是必須進(jìn)行清潔處理。

蛋白質(zhì)層析填料的清潔通常使用強酸（如0.1-1mol/L鹽酸或醋酸）、強堿（如0.2-2mol/L氫氧化鈉）、高濃度鹽（如1-5mol/L?NaCl）、有機溶劑（如5-50%(v/v)乙醇）等清潔劑中的一種，也可以組合使用或順序使用它們中的幾種。但一方面這種使用不一定完全清除層析填料污染的雜質(zhì)，另一方面這種使用還有可能破壞層析填料，從而影響層析填料的壽命和/或結(jié)合能力。這一點對親和層析填料的影響尤其明顯，更尤其對以蛋白質(zhì)為配基的親和層析填料影響非常明顯。

當(dāng)親和層析填料中的配基為蛋白質(zhì)，例如抗體時，由于蛋白質(zhì)遇強酸、強堿、強有機溶劑、高濃度鹽時極容易變性，而親和層析純化的原理利用的又是親和層析填料配基與目標(biāo)蛋白質(zhì)之間基于各自構(gòu)型與活性的高度特異性結(jié)合，所以以蛋白質(zhì)為配基的親和層析填料不能用常規(guī)的強酸、強堿、強有機溶劑、高濃度鹽處理，這也就造成了這類填料清潔處理的困難。基于這一問題，在治療用單克隆抗體類藥物的層析純化過程中，使用了修飾蛋白A（Protein?A）配基的MabSelect系列填料，其可以耐受0.1-0.5mol/L氫氧化鈉短時的清潔處理。但使用該系列填料層析純化單克隆抗體卻大大增加了層析純化的成本，且層析填料耐強堿處理的能力也只是得到了有限的提高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，以在保證甚至提高清潔效果的基礎(chǔ)上大幅度的降低清潔過程對蛋白質(zhì)層析純化填料結(jié)合能力的破壞，從而延長蛋白質(zhì)層析純化填料的使用壽命。

為實現(xiàn)此目的，在基礎(chǔ)的實施方案中，本發(fā)明提供蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法，其是用清潔有效量的質(zhì)量體積比濃度為0.05%-5%的苯扎氯銨（苯扎氯銨也稱為“潔爾滅”）水溶液清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料。

本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)層析純化填料可以是任何類型可以用于純化蛋白質(zhì)的層析填料，優(yōu)選離子交換層析填料、凝膠或分子排阻層析填料、疏水層析填料和親和層析填料，更優(yōu)選親和層析填料，并最優(yōu)選以蛋白質(zhì)為配基的親和層析填料。

本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)可以是任何天然的或重組的蛋白質(zhì)；可以是結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，也可以是功能蛋白質(zhì)；可以是藥用的蛋白質(zhì)，也可以是非藥用的蛋白質(zhì)，但優(yōu)選藥用的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔方法可以是在位清潔，也可以是拆卸層析純化填料后的離線清潔，但優(yōu)選在位清潔。在位清潔時可以用質(zhì)量體積比濃度為0.05%-5%的苯扎氯銨水溶液連續(xù)沖洗層析填料，沖洗體積優(yōu)選3-200個柱體積；也可以在將清潔液充滿所述的蛋白質(zhì)層析純化填料后，密閉裝填所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的蛋白質(zhì)層析純化柱一段時間以達(dá)到清潔作用，密閉層析柱的時間優(yōu)選在0.5-10小時之間；還可以綜合以上兩種方法，以既可減少清潔液連續(xù)沖洗所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的體積，也可縮短密閉層析柱后的清潔時間。

本發(fā)明清潔所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的苯扎氯銨的濃度可以通過測試下文所述的蛋白質(zhì)層析純化填料的清潔效果，以及清潔前后蛋白質(zhì)層析純化填料的結(jié)合能力的變化確定，同時還要考慮苯扎氯銨在水中的溶解性、苯扎氯銨在清潔后是否會有殘留。由此確定的苯扎氯銨的質(zhì)量體積比濃度為0.05%-5%，更優(yōu)選質(zhì)量體積比濃度為0.1%-1%。