[發(fā)明專利]高活力表達疏綿狀嗜熱絲胞菌脂肪酶LN的酵母工程菌株

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201310547209.5
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN103555600A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發(fā)明（設計）人: 李萌;郭曉紅;李多川
• 申請（專利權）人: 山東農業(yè)大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12R1/84;C12R1/645
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

（一）技術領域

本發(fā)明涉及一株高活力表達疏綿狀嗜熱絲胞菌脂肪酶LN的酵母工程菌株，屬于生物工程領域。?

（二）背景技術

脂肪酶（lipase,EC3.1.1.3），全稱三酰甘油酰基水解酶，廣泛存在于生物體內。脂肪酶底物是甘油酯類，水解位點是甘油和12個碳原子以上不溶性長鏈脂肪酸所形成的酯鍵，能夠分解生物產生的各類天然油和脂肪。作為一種界面酶，脂肪酶的水解反應只發(fā)生在油-水界面上，即水溶性的酶在水不溶的底物和水的界面上催化反應。微生物來源的脂肪酶由于作用多樣、易于培養(yǎng)、產量豐富等特點而被廣泛用于工業(yè)生產，其中熱穩(wěn)定脂肪酶的研究和開發(fā)更是具有重要的商業(yè)價值。?

疏綿狀嗜熱絲孢菌（Thermomyces?lanuginosus），它分布廣泛，生長上限較高，產生的脂肪酶具有較高的工業(yè)價值。T.lanuginosus脂肪酶能在畢赤酵母中分泌出具生物活性的目的蛋白，而且表達產物同樣具有原始菌株T.lanuginosus脂肪酶的優(yōu)良特性。?

定向進化具體應用到酯酶和脂肪酶的改造上的成功的方法和策略，以及近些年來，所取得了重要研究進展。定向進化技術已經在酯酶和脂肪酶性質改造領域取得的巨大成功，主要集中于提高酶的催化反應活性，改進底物特異性，提高熱穩(wěn)定性，對映立體選擇性等方面。?

（三）發(fā)明內容

以表達疏綿狀嗜熱絲孢菌（T.lanuginosus）脂肪酶LN的畢赤酵母工程菌GS-TA-LN為出發(fā)菌株，利用定向進化的方法對其進行分子改造。并通過高通量篩選方法最后篩選出一株正向突變菌株GS-TA-LN4，對此工程菌進行發(fā)酵，通過硫酸銨沉淀、?DEAE-Sepharose陰離子交換柱層析等步驟純化了突變蛋白并測定酶活，結果其酶活是野生菌株所產酶活力的3.4倍。對此突變基因進行測序，并與野生基因比較得出，GS-TA-LN4中脂肪酶基因較原始的脂肪酶基因ln有4個堿基發(fā)生改變，分別是第153為由A變?yōu)镚（密碼子由GCA變?yōu)镚CG），氨基酸未發(fā)生變化，都編碼丙氨酸（Ala，A）；第287位由T變?yōu)镃（密碼子由GTG變?yōu)镚CG），引起了氨基酸的變化，第96位氨基酸由丙氨酸（Ala,A）變?yōu)槔i氨酸（Val,V）；第378位由T變?yōu)镃（密碼子由GCT變?yōu)镚CC），氨基酸未發(fā)生變化，都編碼丙氨酸（Ala，A）；第395位由G變?yōu)锳（密碼子由CGG變?yōu)镃AG），引起了氨基酸的變化，第132位氨基酸由谷氨酰胺（Gln,Q）變?yōu)榫彼幔ˋrg,R）。?

（四）附圖說明：

圖1：易錯PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳?

泳道M：Marker-DL2000?

泳道1：cDNA(ORF)?

圖2：平板透明圈法篩選酵母轉化子?

圖3：含G418的YPD平板篩選酵母轉化子?

圖4：GS-TA-LN4表達脂肪酶的SDS-PAGE?

泳道M：低分子量蛋白Marker?

泳道1：純化的重組脂肪酶GS-TA-LN4?

圖5：GS-TA-LN與GS-TA-LN4酶液的酶活力比較?

圖6：GS-TA-LN與GS-TA-LN4脂肪酶氨基酸序列比對?

（五）具體實施方式：

實施例1：疏綿狀嗜熱絲孢菌（T.lanuginosus）脂肪酶LN突變體庫的構建?

（1）易錯PCR及條件摸索：?

采用易錯PCR法對目的基因進行改造。引物為：?

上游引物LN-5’：5’-TTGCTACGTACGGCCTGTTCGACGAGC-3’（SnaBⅠ）?

下游引物LN-3’：5’-GGCCTAGGTTAATCACACTCTGAAATGGG-3’（AvrⅡ）?

易錯PCR反應體系摸索：50μL體系中含1×TaqDNA聚合酶緩沖液、0.2mmo1/L?dATP和dGTP，1.0mmo1/L?dCTP和dTTP，10μmol/L上下游引物、4-7mmo1/LMg²⁺、0-5mmo1/L?MnCl₂模板DNA從質粒擴增獲得。?

PCR反應體系：?

PCR反應條件：?