[發明專利]增強表達的內含子序列及其用途

有效

• 申請號: 201310546198.9
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN103555716A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 徐雯;楊進孝;魏雪松;張成偉
• 申請（專利權）人: 北京大北農科技集團股份有限公司;北京大北農科技集團股份有限公司生物技術中心
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/113;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種增強表達的內含子序列及其用途，特別是涉及一種增強表達的水稻MBF1轉錄因子的內含子及其用途。

背景技術

植物遺傳工程的最新進展為改善植物性狀的工程打開了新的大門，如植物抗病性、昆蟲抗性、除草劑耐受性、提高產量、改善植物可食用部分的營養質量和增強從植物中獲得的終端消費產品的保質期或穩定性。因此，具有分子功能的目的基因可以被適當的整合入植物的基因組以傳遞不同或者改善性狀或質量。適宜的基因表達速率在得到所需要的表型中發揮重要作用。基因表達速率主要受到特定基因的啟動子、位于5’非轉錄區和5’非翻譯區內的額外DNA序列及終止子序列的調節。啟動子是位于基因5’末端的部分DNA序列，其含有RNA聚合酶啟動轉錄以至于蛋白質合成隨后可以繼續進行的信號。位于5’非轉錄區內的調節性DNA序列調節應答特定生物性刺激（例如病原體感染）或非生物刺激（例如鹽脅迫、熱脅迫、干旱脅迫）的基因表達。此外，已經鑒定了以不依賴位置和方向的方式提高位于附近基因的表達水平的其它所謂“增強子”序列。

除了位于基因非轉錄區內的元件（例如啟動子、增強子）以外，已報道了類型廣泛的生物（例如線蟲、昆蟲、哺乳動物和植物）中的一些內含子具有增強基因表達的特性。在植物中，相對于缺少內含子的構建體而言，在基因構建體內包含一些內含子導致增加mRNA和蛋白質累積。這種效應被稱作基因表達的“內含子介導性增強（IME）”。已知在植物中刺激表達的內含子已經在玉米基因和水稻基因中得到鑒定。類似地，已經發現來自雙子葉植物基因的內含子可以提高基因的表達速率，如來自矮牽牛、馬鈴薯和擬南芥的內含子。且已經證實在內含子剪接位點內的缺失或突變降低基因的表達，表明剪接作用可能是IME所需要的。

通過內含子增強基因的表達不是普遍現象，因為向重組表達盒插入一些內含子未能增強表達，例如來自雙子葉植物基因的內含子（來自豌豆的rbcS基因、來自菜豆的菜豆蛋白基因和來自馬鈴薯的stls-1基因）和來自玉米基因的內含子（adh1基因第9內含子、hsp81基因第1內含子）。因此并非每一內含子都可以在轉基因植物中操縱外源基因或內源基因的基因表達水平。內含子序列內必須存在何種特征性或特異性序列特點以增強給定基因表達在現有技術中是未知的，并且從現有技術中不可能預測給定的植物內含子在使用時是否將引起IME。

將外來基因導入新的植物宿主并不總是導致引入基因高表達。此外，若處理復雜性狀，有時候需要以時間差異表達方式或空間差異表達方式調節數個基因。例如，玉米Ubi1啟動子表達量很高，容易導致外源蛋白大量積累而影響作物生長；水稻Actin1啟動子在玉米的生殖組織中表達量比較高，而在營養組織中表達偏低。內含子原則上可以對此進行調節。為了解決上述缺陷，以便產生更好的具有復合性狀的轉基因作物，需要獲得更多具有增強表達特性的內含子用于構建適宜的重組DNA構建體。

發明內容

本發明的目的是提供一種增強表達的內含子序列及其用途，即新的分離自水稻（Oryza?sativa）的MBF1（Multiprotein?bridging?factor1）轉錄因子的內含子，所述內含子與其它啟動子組合后，使異源核苷酸序列能夠在植物組織中高效表達。

為實現上述目的，本發明提供了一種內含子，其核苷酸序列包括如下序列：

（a）具有SEQ?ID?NO:1所示的核苷酸序列；或

（b）在（a）中的核苷酸序列經過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且具有增強基因表達特性的由（a）衍生的核苷酸序列；或

（c）在嚴格條件下與（a）或（b）限定的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。

上述嚴格條件可為在6×SSC（檸檬酸鈉）、0.5%SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液中，在溫度65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1%SDS和1×SSC、0.1%SDS各洗膜1次。

為實現上述目的，本發明還提供了一種嵌合啟動子，包括至少一個所述內含子，所述內含子有效連接至少一個任意啟動子。

在上述技術方案的基礎上，所述啟動子來源于植物或病毒。

進一步地，所述啟動子可以為Ubi基因啟動子。所述Ubi基因啟動子可以為玉米Ubi基因啟動子

更進一步地，所述Ubi基因啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:2所示。

優選地，所述嵌合啟動子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:3所示。