[發明專利]一種胞外分泌表達κ-卡拉膠酶的重組菌構建方法及其應用

無效

• 申請號: 201310542183.5
• 申請日: 2013-10-29
• 公開（公告）號: CN103555753A
• 公開（公告）日: 2014-02-05
• 發明（設計）人: 牟海津;劉哲民
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N9/42;C12R1/19
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及表達κ-卡拉膠酶的重組菌構建方法及其應用。

背景技術

κ-卡拉膠酶(κ-carrageenase，EC3.2.1.83)主要來源于海洋細菌，通過裂解κ-卡拉膠的β-1,4-糖苷鍵產生不同分子量的卡拉膠寡糖。卡拉膠酶的用途廣泛，如紅藻細胞壁結構分析，紅藻原生質體的制備和卡拉膠寡糖的制備等。現已報道，卡拉膠寡糖及其衍生物具有很好的生物活性，如抗腫瘤、抗病毒、免疫調節、抗凝血等。因而引起人們的極大關注，現已成為醫藥、農業、食品等領域研究與開發的高科技競爭熱點。

然而，傳統的化學和物理降解方法反應條件不易控制、產物分布不均勻，根本無法進行大量高純度寡糖的制備。因此，反應條件溫和、底物專一的卡拉膠酶成為目前制約卡拉膠寡糖構效關系研究乃至進一步應用開發的主要瓶頸，獲得高效的κ-卡拉膠酶產生菌和高活性的κ-卡拉膠酶具有重要的科研和應用價值。

κ-卡拉膠酶來源廣泛，主要包括微生物和海洋動物。能夠產生κ-卡拉膠酶的微生物大部分來自海洋細菌，已經在假單胞菌屬、別單胞菌屬、Zobellia菌屬、噬纖維菌屬、弧菌屬等中檢測到。為了發揮模式微生物，如大腸桿菌(Escherichia?coli)等易培養、發酵工藝成熟和生產周期短的優點，利用模式微生物進行異源表達生產κ-卡拉膠酶不失為一種有效的酶改造途徑。現在已經有許多蛋白在大腸桿菌中實現表達，但大多數異源表達的蛋白容易形成包涵體積聚在細胞質中，無法大規模的回收活性蛋白。

重組酶的分泌表達特別是胞外生產具有以下優點：①所表達的重組酶經特定的蛋白酶切后的氨基酸序列與天然基因序列所編碼的蛋白一致，保證了蛋白的天然構象和活性。②胞外分泌的重組酶回收過程不需要細胞破碎，同時菌株自身分泌胞外蛋白量少，簡化了純化步驟。③分泌表達的重組酶在周質空間中容易形成正確的二硫鍵，因為周質空間提供了相對優越的氧化環境。④重組酶的胞外分泌利于發酵過程的連續化，結合高密度培養技術，過程容易放大。重組酶的分泌能力取決于宿主菌、表達載體、信號肽的類型和異源表達蛋白的種類。基于上述優點，目前通過反復實驗法選擇適用于特定重組酶的信號肽和異源表達宿主菌，以實現其胞外分泌表達的報道已有很多。但重組酶胞外分泌的能力大小不一。有關重組κ-卡拉膠酶胞外分泌表達的報道較少，Tohru?Kobayashi等曾報道用大腸桿菌表達系統分泌表達κ-卡拉膠酶，無論是總體酶產量還是胞外酶比例都處于較低水平。

發明內容

本發明的目的在于提供一種具有胞外產κ-卡拉膠酶的重組菌。

本發明提供的重組菌是含有κ-卡拉膠酶前體基因的大腸桿菌。

上述κ-卡拉膠酶前體基因的編碼序列如GenBank號為KC503903所示，其中包含有該κ-卡拉膠酶的原始信號肽序列。

上述κ-卡拉膠酶前體基因cgkZ是通過重組表達載體A導入大腸桿菌當中，得到重組κ-卡拉膠酶產生菌BL21-HTa-cgkZ.

上述重組表達載體A是將所述κ-卡拉膠酶前體基因cgkZ插入pProEX-HTa的多克隆位點得到的重組表達載體pProEX-HTa-cgkZ。

所述載體pProEX-HTa-cgkZ是pProEX-HTa經BamH1和XhoI雙酶切得到的片段，與同樣酶切得到的κ-卡拉膠酶目的片段連接得到。

上述重組菌在產κ-卡拉膠酶中的應用也屬于本發明所保護的范圍之內。

上述應用是指將所述的重組菌在改良LB培養基中發酵培養；所述發酵條件為20-28℃，pH為4.0-6.5，轉速130-180rpm。

本發明采用大腸桿菌作為宿主菌分泌表達κ-卡拉膠酶。由于完整的蛋白質序列是κ-卡拉膠酶成熟并產生活性所必需的，因此將κ-卡拉膠酶前體編碼核苷酸序列置于強啟動子lac的調控之下，并將κ-卡拉膠酶原始信號肽OmpZ與表達載體連接構建分泌型表達質粒pProEX-HTa-cgkZ，導入大腸桿菌得到的重組菌BL21-HTa-cgkZ.該重組菌具備大量胞外分泌重組κ-卡拉膠酶的能力，約51％的酶可以被分泌到胞外，約33％的酶滯留在細菌壁膜間隙。得到的重組酶不需要特定的蛋白酶進行酶切就能表現出較高酶活力，在優化后的搖瓶試驗條件下，重組菌BL21-HTa-cgkZ在誘導發酵28h時，發酵液中κ-卡拉膠酶的酶活達9.4U／mL。

附圖說明

圖1為κ-卡拉膠酶前體基因(GenBank序列號KC503903)

圖2為胞外分泌型載體pProEX-HTa-cgkZ示意圖。

圖3重組κ-卡拉膠酶酶學性質曲線。