[發明專利]一種采用巢式PCR檢測脊柱結核分枝桿菌的方法及其專用引物

在審

• 申請號: 201310541387.7
• 申請日: 2013-11-06
• 公開（公告）號: CN104131068A
• 公開（公告）日: 2014-11-05
• 發明（設計）人: 王文軍;左建宏;宋西正
• 申請（專利權）人: 王文軍;左建宏;宋西正
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 衡陽市科航專利事務所 43101
• 代理人: 劉勛階

技術領域

本發明涉及一種病原微生物的檢測方法及其專用引物，具體來說就是一種采用巢式PCR檢測脊柱結核分枝桿菌的方法及其專用引物。?

背景技術

據世界衛生組織統計,全世界現有結核病人2000萬,每年新發生約800萬例,全世界平均每15秒就有一人死于結核病，每天有5000人因此喪生，僅2006年，就有200萬人死于該病,約1/3人群有潛伏性結核分枝桿菌（mycobacterium?tuberculosis,?MTB）感染。在發展中國家，由于耐藥結核菌株的出現，人口劇增、移民增加、旅游業發展、酗酒與貧困、吸毒、合并獲得性免疫缺陷病毒（HIV）感染、以及治療性免疫抑制癥導致的傳染性結核病發病率逐年上升，從而使結核病控制趨勢更加嚴峻。結核是成年人最主要的傳染病殺手，也是HIV攜帶人群死亡的最主要感染原因。全球每年在結核方面的經濟支出至少在120億美元以上。?

骨關節結核是最常見的繼發肺外結核，約占肺外結核發病率的10％，脊柱結核俗稱脊柱癆、龜背痰，在骨結核中最為常見，發病率約為50％，而45％脊柱結核病人常常因為椎體逐漸破壞、塌陷，后凸畸形進行性加重，最后導致脊髓或神經根損害，嚴重者發生遲發性麻痹，甚至截癱。?

因此對結核病的檢測變得尤為重要，目前對脊柱結核的臨床診斷主要依靠臨床癥狀、實驗室及影像學檢查。影像學檢查包括X片、CT和MRI等，特別是重建CT的應用，可獲得椎體隱匿病變的立體印象；平片在脊柱結核的診斷是首選的，但是其敏感性不高，在許多脊柱結核患者，臨床癥狀很明顯時，X平片可無表現，而在平片中被發現時，椎體50％的骨礦已丟失，MRI作為較好的診斷技術之一，但做為普查及初篩時的檢查，因其價格高而不能廣泛使用。許多脊柱結核的臨床癥狀和影像學表現多在疾病的中晚期出現，有的甚至不典型，故其診斷的及時性有限。結核的實驗室檢查包括涂片，菌培養及免疫學檢查。結核病的細菌學檢查，是發現傳染源的主要途徑和手段，是確定結核病診斷和化療方案的重要依據，但由于MTB的生長緩慢，脊柱結核患者排菌量少,致使作為“金標準”的結核細菌學培養存在著靈敏度低，操作復雜，需時較長，影響因素多，不易標準化等缺點；另外，由于脊柱、脊髓的解剖特性，脊柱結核起病隱匿，對脊柱結核，病灶取材多為有創檢查，且椎體或深部膿腫的穿刺需要一定的技術要求，從而限制了其廣泛應用；免疫學中的純化蛋白衍生物(PPD)試驗陽性率低，特異性差。因此，一種快速、靈敏、準確的早期脊柱結核診斷方法顯得十分重要的意義。?

自1985年美國PE?Cetus公司的Kary?Mullis建立聚合酶鏈反應（Polymerase?chain?reaction,?PCR）技術以來，PCR技術因其靈敏、特異、快速,已被廣泛應用于遺傳診斷、基因研究及病原體的檢測等各方面，極大推動了生命科學的研究進展。而PCR自1989年引入結核病的檢測以來,該技術對于難以培養、生長緩慢的結核分枝桿菌的分子生物學研究有著獨特的意義，近年來，以PCR為基礎的新型基因診斷技術發展很快，目前，不少學者正在探索如將特異性強的DNA探針與敏感性高的PCR技術相結合，并已成功用于臨床標本結核分枝桿菌的檢測。PCR技術目前在檢測肺結核患者的痰液及其外周血中結核分枝菌DNA含量方面已較成熟，在脊柱結核患者膿液中檢測結核分枝桿菌DNA含量方面也有很多研究，但用巢式PCR探討快速檢測結核分枝桿菌DNA及其含量的研究及臨床應用，國內外文獻報道較少。?

發明內容

本發明的目的是提供一種采用巢式聚合酶鏈式反應（簡稱巢式PCR）來檢測結核分枝桿菌DNA的方法及其專用引物。?

其中兩對引物為以SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2為上游引物，以SEQ?ID?No.3和SEQ?ID?No.4為下游引物；所述引物對組的核苷酸序列分別為：?

上游引物A:TB(5,-GGCGGGACAACGCCAATTGCG-3,)

上游引物B:TB(5,-ACGACCACATCAACC-3,)

下游引物C:TB(5,-AGTTTGGTGTCATCAGCC-3,)

下游引物D:TB(5,-CGAGCTAGGCGTCGGTGACAAAG-3,)。

????上述引物的含量分別為：?

上游引物A:?290bp(SEQ?ID?No.1)

上游引物B:?856bp(SEQ?ID?No.2)

下游引物C:?505bp(SEQ?ID?No.3)

下游引物D:?670bp(SEQ?ID?No.4)。