[發明專利]淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備、檢測及其應用

有效

• 申請號: 201310541297.8
• 申請日: 2013-11-05
• 公開（公告）號: CN103539856A
• 公開（公告）日: 2014-01-29
• 發明（設計）人: 陳保善;鄒承武;蒙姣榮;張蕾;盧曉靜
• 申請（專利權）人: 廣西大學
• 主分類號: C07K16/08
• 分類號: C07K16/08;C07K16/06;G01N33/569;G01N33/543;G01N33/68;C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/94
• 代理公司: 廣西南寧公平專利事務所有限責任公司 45104
• 代理人: 楊立華

技術領域

本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種淮山藥溫和花葉病毒的NIb/CP蛋白原核表達、多克隆抗體制備、檢測及其應用。

背景技術

淮山藥又稱山藥、淮山，為薯蕷科植物，其塊根富含淀粉、蛋白質、維生素、氨基酸及多種藥用成分如膽堿、皂甙、粘多糖等，還含有Fe、Zn、Cu、Ca等多種礦物質，依據種和品種的不同，可作藥用或食用，具有良好市場前景和產業開發潛勢。病毒病嚴重影響淮山藥的產量和品質，在淮山藥生產上造成重大損失。文獻表明，全球范圍內，自然條件下侵染淮山藥的病毒有桿狀DNA病毒屬的參薯桿狀病毒(Dioscorea?alata?bacilliform?virus，DaBV)、淮山藥花葉病毒(Yam?mosaic?virus,YMV)、淮山藥溫和花葉病毒(Yam?mild?mosaic?virus,YMMV)、中國淮山藥壞死花葉病毒（Chinese?yam?necrotic?mosaic?virus，CYNMV）、日本淮山花葉病毒（Japanese?yam?mosaic?virus，JYMV）、蠶豆萎蔫病毒2（Broad?bean?wilt?virus-2，BBWV-2）。我國已發現DaBV、YMMV、JYMV、CYNMV和BBWV-2侵染淮山藥，引發的癥狀包括花葉、斑駁、脈明、褪綠、生長遲緩和葉片扭曲等。不同淮山藥病毒引起癥狀不同，也可以引起相似癥狀；其傳播介體不一樣，有不同的傳播途徑。為了保證淮山藥生產的正常進行，首先要保證種薯不攜帶病毒，其次是在生產大田及時發現和鑒定病毒，以便制定有針對性的防治措施，包括控制傳播介體來切斷病毒病的傳播。因此，要求有靈敏度高、特異性好的病毒檢測技術來對淮山藥的種薯和田間樣本進行檢測。目前，用于植物RNA病毒病原檢測的主要技術手段有RT-PCR、IC-RT-PCR、qRT-PCR、LAMP-PCR、ELISA、Western?blot等，在病毒病原檢疫檢測方面應用最多的是ELISA和qRT-PCR。

發明內容

本發明要解決的技術問題是提供一種淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備、檢測及其應用，以便用于快速檢測淮山藥溫和花葉病毒。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，原核表達純化淮山藥溫和花葉病毒的NIb/CP蛋白并用于免疫家兔制備多克隆抗體。

NIb/CP蛋白具有序列表SEQ.ID.No.1的氨基酸序列，或由具有序列表SEQ.ID.No.2的堿基序列的基因所編碼。

上述的淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體制備方法，取純化后的NIb/CP蛋白，采用皮下多點注射法免疫新西蘭大白兔，以后每2周加強免疫一次，共免疫4次；首次免疫加入與蛋白等量的弗氏完全佐劑，后3次加入與蛋白等量的弗氏不完全佐劑；末次加強免疫7天后，心臟采血，分離血清；抗血清經抗原親和純化獲得該病毒NIb/CP蛋白的多克隆抗體。

所得淮山藥溫和花葉病毒的多克隆抗體在檢測淮山藥溫和花葉病毒方面的應用。

基于上述多克隆抗體的淮山藥溫和花葉病毒的ELISA檢測方法。

上述ELISA檢測方法，包括以下步驟：

（1）用1mL抗原包被緩沖液研磨0.1g淮山藥新鮮葉片，9000rpm離心5min，取上清液稀釋20倍，按照100μl/孔加入ELISA板；以感染YMMV的病葉為陽性對照，未感染YMMV的健康葉為陰性對照，37℃孵育2h或4℃過夜；

（2）用200μl?PBST洗滌兩次后，用5%脫脂奶粉封閉30min；

（3）用200μl?PBST洗滌兩次后，每個孔中加入用抗體稀釋緩沖液按照1:8000稀釋的YMMV多克隆抗體，100μl/孔，37℃孵育1h或室溫孵育3h；

（4）用200μl?PBST洗滌兩次后，每個孔中加入用抗體稀釋緩沖液稀釋3000倍的辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔IgG結合物，100μl/孔，室溫孵育1h；

（5）用200μl?PBST洗滌三次后，用TMB底物顯色試劑盒（康為世紀公司）進行顯色，室溫避光孵育25-30min，反應產物呈藍色，每孔再加入50μl0.5M?H₂SO₄終止顯色，此時藍色產物變為亮黃色，立即用酶標儀讀取OD₄₅₀的值，以與陰性OD值比值（P/N）大于2.1為陽性；