[發明專利]豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法

有效

• 申請號: 201310540683.5
• 申請日: 2013-11-05
• 公開（公告）號: CN103525944A
• 公開（公告）日: 2014-01-22
• 發明（設計）人: 李應國;王昱;聶福平;楊俊;肖進文;王國民;袁曾壯
• 申請（專利權）人: 重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 重慶市恒信知識產權代理有限公司 50102
• 代理人: 劉小紅

技術領域

本發明涉及動物疫病分子生物學檢測方法及檢測試劑領域，具體涉及一種豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物、試劑盒和檢測方法。

背景技術

動物衣原體病(Chlamydiosis)是由各類衣原體(Chlamydia)感染哺乳動物、禽類等動物所發生的一類十分重要的自然疫源性傳染病。該病呈地方流行，常造成很大危害及經濟損失。衣原體科的最新分類研究表明，衣原體科（Chlamydiaceae）分為衣原體屬（Chlamydia）和嗜衣原體屬（Chlamydophila），包括沙眼衣原體（Chlamydia?trachomatis）、豬源衣原體(Chlamydia?suis)、鼠沙眼衣原體（Chlamydia?muridarum）、流產嗜衣原體(Chlamydophila?abortus)、貓嗜衣原體(Chlamydophilafelis)、家畜嗜衣原體(Chlamydophila?pecorum)、肺炎衣原體(Chlamydophila?pneumoniae)和鸚鵡熱衣原體(Chlamydophila?psittaci)。感染動物的衣原體主要有6種：豬源衣原體、貓衣原體、家畜衣原體、肺炎衣原體和鸚鵡熱衣原體。豬源衣原體是屬于衣原體屬的一個種，豬是豬源衣原體的天然宿主。目前只是從豬中分離得到，在豬的腸道樣品中分離率最高。豬源衣原體對養豬業有著很大的影響。各種品系的豬都能感染豬源衣原體，并導致豬的結膜炎、肺炎或無癥狀亞臨床感染，本病對四環素敏感。從美國愛荷華州和內布拉斯加州、意大利和比利時的農場分離出對四環素不敏感的豬源衣原體，這種穩定的耐四環素表現型與染色體中存在耐藥基因有關。由此可見豬源衣原體的防控對養豬業尤為重要。從而也可以通過檢測豬肉食品中是否含有豬源衣原體來進一步降低感染的可能性。

?TaqMan探針是一種寡核苷酸探針，熒光基團鏈接在探針的5^，末端，淬滅基團則在3，端。當探針與靶序列配對時，熒光基團發射的熒光因與3^，端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5^，外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發射熒光。一分子的產物生成就會伴隨著一分子的熒光信號的產生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的熒光基團不斷的積累。因此TaqMan探針檢測的是積累熒光。目前，水解探針已被用于基因檢測、病毒定量、癌細胞基因微突變檢測、細胞因子基因定量等，其結果都具有高特異性與高敏感性。

????TaqMan-MGB探針是近年來的一種新型探針，它的淬滅基團是一種非熒光的淬滅基團，本身不會發生熒光，這樣就降低了PCR反應熒光本底信號的強度，進一步提高了其敏感性。

中國發明專利（申請號為：200910103457.4?、200910094278、200480005196.8、201310009019.8?、201180015187.7?、201110143186.2、201110279330.5?、200910200396.3、200910200393.X?、200910094272.1、200910094279.3?等）分別公開了采用熒光定量PCR擴增技術檢測病菌和動物疫病的方法。但是，目前尚無利用TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR擴增技術檢測豬源衣原體(C?.cuis)的試劑盒及檢測方法的報道。

發明內容

為克服現有技術的不足，本發明的第一個目的是提供一種豬源衣原體TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，第二個目的是提供使用該引物的檢測試劑盒，第三個目的是提供使用上述檢測用引物和試劑盒檢測肉制品的檢測方法。

為了實現上述第一個目的，本發明提供的豬源衣原體TaqMan-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用引物，包括豬源衣原體上游引物，其DNA序列為SEQ?ID?NO.1;豬源衣原體下游引物，其DNA序列為SEQ?ID?NO.2；豬源衣原體MGB探針，其DNA序列為SEQ?ID?NO.3。

為了實現上述第二個目的，本發明采用的技術方案是：豬源衣原體Taqman-MGB探針實時熒光定量PCR檢測用試劑盒包括擴增反應液管、陽性對照管、陰性對照管和滅菌去離子水管，其中：

所述擴增反應液管，管內由以下反應液組成：