[發(fā)明專利]一種鵝組織中多胺含量的高效液相色譜檢測(cè)方法及其應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201310537524.X
• 申請(qǐng)日: 2013-11-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN103575826A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-02-12
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 康波;姜冬梅;何琿;王繼文;馬容;李亮;王迅;韓春春;劉賀賀;許恒勇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N30/02
• 分類號(hào): G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于高效液相色譜檢測(cè)方法，本發(fā)明涉及的是一種鵝組織中多胺含量的高效液相色譜檢測(cè)方法及其應(yīng)用，具體包括鵝組織中多胺的固相萃取方法和高效液相色譜法檢測(cè)萃取樣品中腐胺、亞精胺和精胺的含量。

背景技術(shù)

多胺（包括腐胺、亞精胺和精胺）是一類帶有兩個(gè)或兩個(gè)以上氨基的低分子脂肪族化合物，它在幾乎所有的真核細(xì)胞生物體內(nèi)都有存在，這一進(jìn)化保守性提示多胺對(duì)于細(xì)胞存活極為重要。在生理pH下，多胺呈高密度的陽(yáng)性電荷，它們能與帶有大量負(fù)電荷的DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合并發(fā)揮其調(diào)控作用。研究表明，多胺可參與調(diào)控基因表達(dá)和翻譯、細(xì)胞增殖、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞膜穩(wěn)定等生命活動(dòng)過(guò)程，并且能夠調(diào)節(jié)某些陽(yáng)離子通道的活性。近年來(lái)，對(duì)多胺生物學(xué)功能的研究越來(lái)越多，研究表明：細(xì)胞內(nèi)多胺濃度降低時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢甚至停止；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)多胺含量過(guò)多時(shí)，可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖。在生長(zhǎng)旺盛的組織中多胺的含量高于生長(zhǎng)緩慢的組織，癌細(xì)胞中的多胺含量遠(yuǎn)高于其它正常的組織。因此，探尋一種快速、準(zhǔn)確檢測(cè)鵝組織中多胺含量的方法，對(duì)于闡明多胺在鵝生命活動(dòng)過(guò)程中所發(fā)揮的生物學(xué)功能以及調(diào)控機(jī)理具有重要的理論意義和實(shí)際意義。

近年來(lái)，隨著鵝產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，鵝產(chǎn)蛋性能較低（一般年產(chǎn)蛋量?jī)H為30~80枚）已成為制約鵝產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素，是鵝產(chǎn)業(yè)亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題之一。鵝產(chǎn)蛋性能主要取決于卵巢中卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育水平，并受品種、環(huán)境和飼養(yǎng)管理等因素的影響。鵝卵泡經(jīng)過(guò)發(fā)育、選擇和閉鎖等機(jī)制建立起嚴(yán)格的等級(jí)體系，原始卵泡經(jīng)等級(jí)前發(fā)育進(jìn)入小黃卵泡庫(kù)，隨后被選擇并進(jìn)入等級(jí)發(fā)育。家禽可通過(guò)調(diào)控起始發(fā)育卵泡的數(shù)量和小卵泡（白卵泡和小黃卵泡）的閉鎖來(lái)調(diào)節(jié)卵巢的功能，同時(shí)還可通過(guò)閉鎖機(jī)制清除排卵前卵泡來(lái)調(diào)節(jié)排卵的速率，進(jìn)而影響家禽的產(chǎn)蛋性能。研究表明，小鼠體內(nèi)多胺含量減少時(shí)，能夠使小鼠卵泡發(fā)育停滯并出現(xiàn)閉鎖。另外，多胺能夠調(diào)控非洲爪蟾卵母細(xì)胞的形成，調(diào)控生殖類激素合成酶的表達(dá)。處于繁殖期的鵝卵巢組織是生長(zhǎng)速度最快的組織之一，且組織中多胺的濃度對(duì)卵泡的發(fā)育起了至關(guān)重要的作用。所以，快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鵝卵泡組織中多胺的含量對(duì)與鵝繁殖相關(guān)研究具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義。

固相萃?。⊿olid-Phase?Extraction，SPE）是近年發(fā)展起來(lái)一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和柱液相色譜技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來(lái)，主要用于樣品的分離、純化和濃縮，與傳統(tǒng)的液液萃取法相比較可以提高分析物的回收率，更有效的將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過(guò)程。由于鵝組織中的多胺存在于組織中，無(wú)法直接運(yùn)用液相色譜檢測(cè)，需要通過(guò)固相萃取以及衍生化反應(yīng)后才能被液相色譜的紫外檢測(cè)器特定波段下的紫外線檢測(cè)到，所以要將組織研磨并用5?%的HClO₄抽提組織中的多胺，之后與苯甲酰氯衍生再用C18固相萃取柱萃取衍生后的多胺。固相萃取的方法繁瑣并很容易由于操作上的失誤導(dǎo)致萃取不成功或萃取不完全，本方案提供了完整的、可行的鵝組織中萃取多胺的方法，該方法操作簡(jiǎn)單、切實(shí)可行。

高效液相色譜檢測(cè)具有分析速度快、分離效能高、靈敏度高、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，但高效液相色譜檢測(cè)時(shí)必須對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，檢測(cè)條件不夠好會(huì)導(dǎo)致高效液相色譜檢測(cè)是出峰時(shí)間分不開(kāi)，檢測(cè)重復(fù)性不好等問(wèn)題。本發(fā)明方案提供了多胺衍生物高效液相色譜檢測(cè)的優(yōu)化方案，色譜條件為：色譜柱SWEEL?Chromstar^TMC18，5?μm，4.6×250?mm；流動(dòng)相比例甲醇:水=62:38（V/V）；流速1.0?mL/min；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為229?mm；進(jìn)樣體積20?μL；柱溫為25℃。本方案色譜條件能夠準(zhǔn)確分開(kāi)組織中腐胺、亞精胺和精胺衍生物的出峰時(shí)間并且具有較高的重復(fù)性。

為闡明鵝體內(nèi)多胺含量、多胺生物學(xué)功能及其調(diào)控機(jī)理，尋找快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)鵝組織中多胺含量的方法是鵝體內(nèi)多胺相關(guān)研究得以開(kāi)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本發(fā)明公開(kāi)了鵝組織中多胺的固相萃取方案以及多胺高效液相色譜檢測(cè)的色譜條件，同時(shí)應(yīng)用該發(fā)明方案檢測(cè)了鵝卵泡組織中的多胺含量。本發(fā)明方案切實(shí)可行，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于從鵝組織中固相萃取腐胺，亞精胺和精胺。該方法操作簡(jiǎn)單，切實(shí)可行，具有較高的重復(fù)性。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案為。