[發明專利]檢測Y染色體微缺失的引物和試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201310537372.3
• 申請日: 2013-11-04
• 公開（公告）號: CN103571957A
• 公開（公告）日: 2014-02-12
• 發明（設計）人: 胡廣慶;張涵;劉曉峰;侯然;梁超;王緒華;方國偉;黃士昂;陳忠
• 申請（專利權）人: 北京海思特臨床檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京天奇智新知識產權代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及基因檢測的引物和試劑盒，尤其涉及一種用于檢測Y染色體微缺失的引物和試劑盒及其使用方法

背景技術

據估計全球約有10%的育齡夫婦不育，其中男性因素引起的生殖障礙約占一半，而因遺傳性因素引發男性不育的比例為30%，其中發病率最高的兩種是克氏綜合癥和Y染色體微缺失，有10～15%的無精癥或少精癥存在Y染色體的微缺失。

Y染色體是最短的近端著絲粒染色體，是男性特有的染色體，Y染色體上有多個基因參與生精過程，研究表明，Y染色體上存在一個關鍵的與生育相關的因子的區域，稱為無精子因子（azoospermiafactor，AZF），目前認為在AZF上存在三個精子發生亞區（AZFa、AZFb、AZFc），各亞區包含的位點在男性生殖細胞發育不同時期起著不同的作用，位點的缺失可致患者表現為少、弱精癥或無精癥從而引發不育，而在AZFb于AZFc之間還存在AZFd座位，中等程度的少精子和精子數目正常卻形態異常多與該區域的缺失有關。AZFa缺失的患者，主要表現為支持細胞綜合癥伴睪丸體積縮小，無精子生成；AZFb缺失的患者，主要表現為生精過程阻滯在精母細胞階段，無精子生成；AZFc缺失的患者表現多樣化，會出現無精子癥和少精子癥的不同臨床表現。對于Y染色體微缺失的原因，普遍認為染色體內的非同源重組是該突變的主要機制。Y染色體微缺失一般在染色體核型分析不易發現，目前主要通過AZF區域的序列標簽位點（Sequence?tagged?sites,STSs）來診斷，根據歐洲男科協會建議的六個STS位點進行Y染色體微缺失的分析，即：AZFa(SY84、SY86)，AZFb(SY127、SY134)，AZFc(SY254、SY255)，對上述位點的分析，Y染色體微缺失的檢測準確率可以達到95%。

當前，Y染色體微缺失檢測的主要方法是通過PCR特異性擴增Y染色體AZF區域的序列標簽位點（STS），再用電泳或Southern?blot雜交等方法檢測PCR擴增產物，但電泳靈敏度低、準確性不高，雜交操作繁瑣、耗時耗力、成本高。

發明內容

為了解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種用于檢測Y染色體微缺失的引物，本發明還公開了包括有該引物的試劑盒及其使用方法。

本申請的發明人根據6個STS位點和內參基因設計特異性引物，通過多重PCR擴增結合DHPLC（變性高效液相色譜分析）檢測，可以快速、準確地檢測Y染色體微缺失。

根據本發明的實施例，提供了一種用于檢測Y染色體微缺失的引物，所述引物包括8對引物，可同時擴增Y染色體上6個基因位點和兩個內參基因；

所述Y染色體上6個基因位點為：SY84、SY86、SY127、SY134、SY254和SY255位點；所述兩個內參基因為：SRY和TP53基因；

特異性擴增SY84位點的引物序列如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，

SEQ?ID?NO:15’-AGAGGAGTCCTGATGCAGGT-3’

SEQ?ID?NO:25’-GCCCATTACCTGGAGCCTTC-3’

特異性擴增SY86位點的引物序列如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示，

SEQ?ID?NO:35’-GTGAACCACAGACATGCTTC-3’

SEQ?ID?NO:45’-ACACACAAGGCGAACCCCT-3’

特異性擴增SY127位點的引物序列如SEQ?ID?NO:5和SEQ?ID?NO:6所示，

SEQ?ID?NO:55’-GGCTCTCACACGAATAGAAA-3’

SEQ?ID?NO:65’-CTGCTGGCACTAATATGGGA-3’

特異性擴增SY134位點的引物序列如SEQ?ID?NO:7和SEQ?ID?NO:8所示，

SEQ?ID?NO:75’-GTCTCGCTCACACTAAAACG-3’

SEQ?ID?NO:85’-ACCAACGCCAATACATTCAA-3’

特異性擴增SY254位點的引物序列如SEQ?ID?NO:9和SEQ?ID?NO:10所示，

SEQ?ID?NO:95’-GGGTCTATCCAGAGAGCAAA-3’

SEQ?ID?NO:105’-GAACCTGATCTAGCAATGCAGC-3’